Искусственные интроны уничтожают раковые клетки с нарушенным сплайсингом

При многих типах рака геномы опухолевых клеток имеют мутации, которые влияют на факторы сплайсинга (в частности, мутации в гене SF3B1). Ранее уже было показано, что такие клетки чувствительны к дальнейшим нарушениям сплайсинга, включая те виды терапии, которые подавляют нормальную сборку и работу сплайсосом. Ученые из США разработали терапию, используя дерегуляцию сплайсинга для уничтожения раковых клеток.

Сначала авторы идентифицировали гены с интронами, которые наиболее сильно и постоянно отвечали на мутации в гене SF3B1. При этом использовали транскриптомные данные 271 пациента. Мутации в SF3B1 активировали криптические 3’-сайты сплайсинга в генах MAP3K7, ORAI2 и TMEM14C, а также воздействовали на вырезание интронов в генах MTERFD3, MYO15B и SYTL1.

Особое внимание ученые уделили гену MTERFD3 — для него обнаружили большое количество различных изоформ. С помощью секвенирования в нем выявили три конкурирующих 3’-сайта сплайсинга. С их помощью авторы создали искусственные интроны длиной в 250 нуклеотидов, которые действовали как молекулярные переключатели. Интроны вставили в кодирующую последовательность mEmerald, которую клонировали в вектор, экспрессирующий mCardinal. Полученные конструкции трансфицировали в клетки с мутациями гене SF3B1 и без мутаций. Авторы измеряли соотношение mEmerald/mCardinal с помощью проточной цитометрии и показали, что некоторые интроны вырезаются только при наличии мутации, что доказывает принципиальную верность их подхода.

В дальнейшем авторы использовали систему с тимидинкиназой вируса простого герпеса (HSV-TK). Обработка клеток, экспрессирующих HSV-TK, ганцикловиром приводит к образованию цитотоксических метаболитов. Искусственный интрон встраивали в кодирующую последовательность HSV-TK; содержащий эту последовательность вектор переносили в клетку. При наличии мутации в гене SF3B1 интрон вырезается, и после обработки ганцикловиром клетка погибает.

Последовательность искусственного интрона оптимизировали с помощью скрининга. Также выявили элементы, критически важные для работы системы. Все это позволило сделать интрон еще короче.

Эффективность терапии проверили in vivo на мышах. В клетки K562 с мутацией в гене SF3B1 и без поместили конструкцию, экспрессирующую HSV-TK с искусственным интроном. Клетки вводили мышам NOD-scid IL2Rg^null, после чего вносили ганцикловир и наблюдали за развитием лейкемии. У мышей, получивших мутантные клетки и ганцикловир, снизилось число раковых клеток, а выживаемость увеличилась по сравнению контролями (получившими клетки без мутации в гене SF3B1 или PBS вместо ганцикловира).

Тот же результат продемонстрировали на модели острого миелоидного лейкоза MOLM-13, а также при смешении популяций клеток. У мышиных моделей рака молочной железы и увеальной меланомы удалось замедлить рост опухоли и повысить выживаемость. Эффекта на здоровые клетки дикого типа практически не наблюдалось.

Таким образом, авторы продемонстрировали работоспособность концепции на нескольких типах рака. Преимущества подхода состоят в небольшом размере искусственного интрона, что облегчает его доставку, возможности подстройки их дизайна, а также в посттранскипционном методе воздействия. Мутации в гене SF3B1 встречаются при многих типах рака, так что, по мнению авторов, подход можно применять достаточно широко. Они планируют продолжать тестирование на моделях миелоидных неоплазий и меланом некожных локализаций, в которых мутации в сплайсосомах особенно распространены.