Клетки острого миелоидного лейкоза изолируют мРНК онкосупрессоров, чтобы выжить

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) — это высокоагрессивный рак крови, характеризующийся неконтролируемой пролиферацией незрелых миелобластов. Поддержание идентичности прогениторных клеток (в том числе миелобластов) обеспечивается посттранскрипционными механизмами, регуляция которых часто нарушена при раке. Авторы статьи в Nature Cell Biology провели геномный CRISPR-скрининг нормальных и злокачественных гемопоэтических предшественниках и выяснили, что при ОМЛ клетки накапливают P-тельца — РНК-белковые комплексы — и «запирают» в них мРНК опухолевых супрессоров.

P-тельца, или тельца процессинга, представляют собой небольшие немембранные органеллы, сформированные РНК-связывающими белками в комплексе с мРНК. Они обеспечивают ее хранение и контролируют сайленсинг. Уже было показано, что компоненты P-телец аберрантно экспрессируются при раке, поэтому ученые предполагают их роль в дестабилизации клеточной идентичности и онкогенезе.

Исследователи провели геномный CRISPR-скрининг в клетках мышиного лейкоза (линия CNC) и нормальных стволовых и прогениторных гемопоэтических клетках (линия HPC7). Они обнаружили 308 генов, необходимых для выживания в CNC, но не в HPC7; анализ генной онтологии выявил обогащение посттранскрипционными регуляторами, связанными с репрессией трансляции и P-тельцами. Результаты подтвердились и для лейкоза у людей — проанализировав открытые транскриптомные данные по раковым клеткам, ученые обнаружили, что некоторые связанные с P-тельцами гены активнее экспрессируются в клетках ОМЛ. В частности, у некоторых пациентов была повышена экспрессия DDX6 и EIF4ENIF1 — они кодируют два ключевых белка, необходимых для репрессии трансляции и секвестрации мРНК в P-тельцах. Это повышение коррелировало с худшей выживаемостью. Иммуноцитохимический анализ показал, что в лейкозных клетках пациентов с ОМЛ действительно было увеличено количество P-телец.

Учитывая роль DDX6 в репрессии трансляции и его необходимость для сборки P-телец, авторы работы проанализировали его функцию в клетках ОМЛ человека. Сначала они подтвердили, что этот белок локализуется в цитоплазме и преимущественно накапливается в P-тельцах — на это указала колокализация DDX6 с маркерами P-телец EDC4 или LSM14A. Выключение этого гена различными способами (нокдаун с помощью shRNA, нокаут с помощью CRISPR-Cas9, CRISPR-интерференция) приводило к разрушению P-телец и нарушало пролиферацию клеточных линий ОМЛ. Кроме того, оно индуцировало миелоидную дифференцировку в линии острого моноцитарного лейкоза (MOLM-13) и мегакариоцитарную — в линии эритролейкоза (HEL), а также вызывало апоптоз в ряде других клеточных линий.

Лигандзависимая обратимая деградация DDX6 подавляла пролиферацию клеток ОМЛ — в локус DDX6 ввели FKBP12^F36V-HA-P2A-mCherry, и нацеленная на FKBP12^F36V малая молекула dTAG-13 индуцировала разрушение DDX6 даже в низких (62,5 нМ) дозах. Более того, непрерывная обработка dTAG-13 в течение шести дней необратимо подавляла пролиферацию клеток лейкоза — реэкспрессия DDX6 не смогла устранить вызванный в эксперименте дефект пролиферации. Это говорит о возможности использования временных и дозовых окон для воздействия на секвестрацию РНК в клетках ОМЛ.

Далее авторы задались вопросом, насколько DDX6 важен для ОМЛ in vivo. Они подсадили иммунодефицитным NSG мышам клетки лейкоза человека, в которых CRISPR-интерференция для подавления DDX6 индуцировалась доксициклином. Сайленсинг DDX6 значительно увеличивал медиану выживаемости мышей-реципиентов. Аналогичные результаты давал нокдаун с помощью shRNA. При этом сначала количество лейкозных клеток, дефицитных по DDX6, снижалось в селезенке и костном мозге, однако некоторые клетки избегали нокдауна и оставались в погибших спустя несколько недель мышах.

Чтобы определить роль DDX6 в возникновении и прогрессии лейкоза, ученые получили мышей с условным нокаутом Ddx6, в гемопоэтическом компартменте которых индуцировали делецию Ddx6 с помощью полиинозиновой:полицитидиловой кислоты (поли(I:C)). Нокаут подтвердили с помощью вестерн-блота и ПЦР, а утрату P-телец — методом иммуноцитохимии. Гемопоэтические стволовые клетки таких мышей трансформировали онкогеном MLL-AF9, чтобы индуцировать лейкоз, а затем подсаживали их животным дикого типа. Оказалось, что делеция Ddx6 препятствовала развитию заболевания.

Сравнение злокачественных и нормальных гемопоэтических стволовых клеток, в которых делетировали Ddx6, показало, что гомеостатический гемопоэз не требует экспрессии этого гена — пролиферация и дифференцировка в здоровых клетках в его отсутствие не нарушалась.

Для выживаемости клеток острого миелоидного лейкоза важны и другие белки, необходимые для сборки P-телец (например, EIF4ENIF1 и LSM14A). Ученые задались вопросом, как утрата P-телец повлияет на фенотип опухолевых клеток. Обработка клеток лейкоза соединениями, индуцирующими дифференцировку, приводила также к разрушению P-телец. Нарушение их сборки снижало пролиферацию клеток.

Более подробный анализ самих P-телец показал, что в них накапливаются трансляционно репрессированные мРНК, кодирующие опухолевые супрессоры (например, KDM5B и TRAF6). Сайленсинг DDX6 при этом значительно увеличивал скорость трансляции этих мРНК. Такая изоляция ряда мРНК в P-тельцах, как выяснилось далее, поддерживает свойственную лейкозу архитектуру хроматина. Авторы работы воспользовались методом ATAC-seq, чтобы оценить изменения в доступности хроматина после нокдауна DDX6. Многие участки в отсутствие DDX6 стали более доступными по сравнению с контролем, причем эти области кодировали ряд генов-онкосупрессоров (например, PCDH8, TUSC3, GATA2, PRDM11 и ARID1B). Напротив, в регионах, терявших доступность при нокдауне DDX6, оказалось множество пролейкемических генов (например, BCL2, SIRT7, MEIS2, BRD4 и IKZF2).

Полученные результаты указывают на связь между дисрегуляцией трансляции и секвестрацией мРНК в P-тельцах. Накопленная в них репрессированная мРНК кодирует ключевые онкосупрессоры, и нарушение секвестрации увеличивало скорость трансляции этих белков, что, в свою очередь, снижало выживаемость лейкозных клеток и замедляло прогрессию заболевания in vivo.

Кольцевые РНК прикрепляются к ДНК и вызывают онкогенные мутации