Клостридия жертвует патогенностью ради приобретения устойчивости к антибиотику

Clostridioides difficile — важный патоген человека, который зачастую становится причиной внутрибольничных инфекций. Выбор препаратов для борьбы с этой бактерией ограничен, и в первую очередь применяется ванкомицин. Резистентность к нему некоторых грамположительных патогенов стала в последние годы серьезной проблемой, однако о высоком уровне устойчивости C. difficile пока не сообщалось. Исследователи из Великобритании установили, что резистентность клостридий к ванкомицину может быстро развиваться под действием отбора, однако за счет плейотропного эффекта меняются и другие признаки, что снижает способность к распространению инфекции.

Ванкомицин — гликопептидный антибиотик, связывающий C-концевые остатки D-Ala-D-Ala предшественников муропептидов и тем самым стерически блокирующий реакции трансгликозилирования и транспептидации. Устойчивость к нему обычно связана с одним из кластеров генов van, которые кодируют ферменты, удаляющие из пептидогликана-предшественника сайт связывания ванкомицина. Хотя весь кластер vanG присутствует у различных штаммов C. difficile, остается неясным, обеспечивает ли он устойчивость к ванкомицину у клостридий. Чтобы это установить, ученые воспользовались методом экспериментальной эволюции in vitro. Они получили штаммы C. difficile с нормальной и увеличенной в 20 раз частотой мутаций — во втором случае из исходного штамма R20291 удалили основные токсины и связанные с ними регуляторные белки, а также нарушили работу системы репарации ДНК (полученный штамм обозначили как R20291ΔPaLocΔmutSL). На основе каждого из двух штаммов затем получили по пять генетически баркодированных производных, которые затем выращивали в присутствии ванкомицина. Резистентность быстро развивалась во всех 10 полученных популяциях, причем устойчивость к высоким концентрациям антибиотика развивалась быстрее в гипермутабельных линиях.

Затем исследователи занялись поиском генетических основ резистентности C. difficile к ванкомицину. Из каждой популяции они отобрали по одному клону, отражающему среднюю устойчивость популяции к антибиотику, и провели полногеномное секвенирование. Также секвенированию подвергали родительские штаммы каждой популяции и один случайный клон, полученный в контрольной линии (выращенной в отсутствие ванкомицина). Ученые сосредоточились на мутациях, которые наблюдались только в обработанных ванкомицином линиях, но не в предковых или контрольных клонах. В эволюционировавших популяциях, произошедших от штамма дикого типа, они наблюдали 1–3 уникальных мутаций на геном, а в гипермутабельных — 14–26.

Параллельная эволюция, при которой мутации в одном и том же локусе возникают независимо в нескольких эволюционирующих популяциях, служит доказательством действия отбора и указывает на возможную роль этих мутаций в адаптации. Она наблюдалась в штаммах дикого типа и затрагивала три локуса: vanT, CDR20291_3437 и comR. При этом мутации в vanT и CDR20291_3437 были взаимоисключающими. VanT — это предполагаемая сериновая рацемаза, кодируемая в кластере типа VanG, который ранее связывали с пониженной восприимчивостью C. difficile к ванкомицину. CDR20291_3437 кодирует предсказанную двухкомпонентную систему гистидинкиназ, а родственный ему регулятор ответа кодируется CDR20291_3438. Хотя эти гены пока не ассоциировали с антибиотикорезистентностью, расположенный рядом CDR20291_3439 кодирует предполагаемую D,D-карбоксипептидазу, которая, по-видимому, модифицирует пептидогликан, удаляя из него концевой D-аланин. Исходя из таких предполагаемых функций, ученые предложили переименовать эти гены в dacS (CDR20291_CD3437, гистидинкиназа), dacR (CDR20291_CD3438, регулятор ответа) и dacJ (CDR20291_CD3439, D,D-карбоксипептидаза).

Приобретение бактериями устойчивости к ванкомицину сказалось на ряде фенотипических черт. Так, антибиотикорезистентные клостридии хуже росли в богатых жидких средах, кроме того, у части из них была в той или иной степени нарушена споруляция (вплоть до ее полного прекращения).

Совокупность геномных и фенотипических данных позволяет предположить, что существует два альтернативных механизма устойчивости к ванкомицину, один из которых связан с dacS, а другой — с vanT. Кластер dacJRS ранее не ассоциировали с резистентностью к этому антибиотику, поэтому авторы работы решили подтвердить его роль, воспроизведя отдельные мутации на чистом фоновом генотипе. Они внесли в штамм дикого типа мутантный вариант dacS и убедились в том, что выявленная ранее в гипермутабельной линии замена увеличивает минимальную ингибирующую концентрацию ванкомицина примерно в четыре раза, то есть снижает чувствительность клостридий к антибиотику. Вместе с тем внесенная мутация ухудшала рост бактерий.

Дальнейший анализ экспрессии dacJ, dacR и dacS с учетом геномной организации кластера позволил исследователям предположить, что двухкомпонентная система dacR/S служит положительным регулятором D,D-карбоксипептидазы dacJ, которая модифицирует C-концевой участок мишеней ванкомицина.

Таким образом, исследование описывает два различных пути развития резистентности к ванкомицину у C. difficile, причем один из этих путей включает ранее не охарактеризованную D,D-карбоксипептидазу, экспрессия которой контролируется специальной двухкомпонентной системой сигналинга. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что, хотя C. difficile способна приобретать устойчивость к высоким концентрациям ванкомицина, из-за плейотропии эта устойчивость сопровождается фенотипическими изменениями, снижающими способность бактерии к росту и размножению.

Бактерия против бактерии: как кишечная палочка помогает бороться с клостридией