Макак-резусов клонировали методом переноса ядер соматических клеток

Технологию переноса ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) использовали для клонирования множества видов млекопитающих, включая овцу, мышь, свинью, козу, кролика и собаку. Не так давно этим же способом была клонирована макака-крабоед (Macaca fascicularis). Это стало возможным благодаря оптимизации протокола SCNT и применению эпигенетических регуляторов, например, гистоновой деметилазы Kdm4d и трихостатина A (TSA), ингибитора деацетилирования гистонов. И все равно эффективность клонирования остается низкой, так как ученые плохо понимают механизмы репрограммирования. До недавнего времени не удавалось клонировать макаку-резуса с помощью технологии SCNT так, чтобы животное прожило дольше 12 часов. В новой работе исследователи из Китая задались целью улучшить эффективность клонирования макаки-резуса с помощью технологии замены трофобласта и применения эпигенетических регуляторов.

Сначала авторы использовали протокол, уже опробованный на макаках-крабоедах: они применили Kdm4d и TSA. Эмбрионы, полученные с помощью технологии SCNT, имели нормальную организацию хромосом в первую M-фазу. Бластоцисты формировались в 47,6% случаев (10 из 21), что чуть ниже, чем при применении ИКСИ (введении сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки). Далее авторы получили 484 клонированных эмбриона и подсадили их 96 суррогатам, в среднем по пять эмбрионов на самку. Однако клонированные эмбрионы имплантировались в два раза реже, чем эмбрионы, полученные в результате ИКСИ (74 из 499 против 35 из 484). Большая часть эмбрионов была потеряна, родился только один детеныш, который прожил менее 23 часов.

Большая часть ИКСИ-эмбрионов была потеряна через 150 дней, а клонированных эмбрионов — через 40 дней. Авторы проанализировали транскриптом и метилом бластоцист, полученных в результате ИКСИ и клонирования.

У клонированных бластоцист был намного ниже уровень метилирования, чем у бластоцист, полученных в результате ИКСИ (30% против 39,6%). Также авторы идентифицировали 19 089 дифференциально метилированных областей. В большей части этих областей уровни ДНК-метилирования были ниже в клонированных бластоцистах, однако присутствовали и гиперметилированные области. Детальный анализ этих областей показал, что ДНК-метилирование, характерное для соматической клетки, может сохранятся до стадии бластоцисты даже после глобального ДНК-деметилирования.

Импринтинг играет важную роль в развитии эмбриона, его нарушение может привести к гибели. Авторы сравнили экспрессию генов и уровни ДНК-метилирования импринтированных генов в клонированных и ИКСИ-бластоцистах. Данные об импринтинге брали из базы данных, относящейся к человеку. Всего авторы идентифицировали четыре гена с нарушенным импринтингом в клонированной бластоцисте: THAP3, DNMT1, SIAH1 и RHOBTB3. Скорее всего, есть больше таких генов. Потеря импринтинга может быть связана с нарушением развития клонированных эмбрионов.

Далее исследователи культивировали эмбрионы, потерянные после имплантации. При этом они изолировали эпибласт, амнион, желточный мешок и небольшое число остатков трофобластов. Оказалось, что уровень ДНК-метилирования в этих тканях был выше, чем у ИКСИ-эмбрионов. Тем не менее, у ранее идентифицированных генов (THAP3, DNMT1, SIAH1 и RHOBTB3) метилирование оставалось нарушенным. Глобальный уровень ДНК-метилирования в плаценте также был выше у клонированных эмбрионов.

Нарушение развития плаценты было описано во многих исследованиях по клонированию млекопитающих. В этой работе также была показана гиперплазия плаценты и аберрантное отложение солей кальция. Более того, плацента клонированных эмбрионов была в полтора раза толще, чем у ИКСИ-эмбрионов.

Для корректировки развития плаценты авторы получили тетраплоидные эмбрионы. На стадии бластоцисты у таких эмбрионов было показано образование внутренней клеточной массы. Далее 49 таких эмбриона подсадили 16 суррогатным матерям, у восьми из которых подтвердили беременность. Родились три детеныша, двое из которых были живы на момент написания статьи (более двух лет), третий детеныш погиб через год после рождения. У всех детенышей был нормальный кариотип. Не совсем понятно, на какой стадии кариотип восстанавливается.

Несмотря на ограниченный успех получения тетраплоидов, авторы разработали также метод замены трофобласта для макак-резусов. Трофобласты клонированных эмбрионов были заменены на трофобласты ИКСИ-эмбрионов. Авторы убедились, что в ходе этой процедуры в полученном эмбрионе не остается внутренней клеточной массы ИКСИ-эмбриона. Из 113 активированных клонированных эмбрионов 11 реконструированных эмбрионов подсадили семи суррогатам. В результате две макаки забеременели, родился один детеныш-самец. Он также был жив уже два года на момент написания статьи. Авторы подтвердили, что клонирование прошло успешно. Детеныш не был химерой, то есть внутренняя клеточная масса донора трофобласта не участвовала в формировании организма. Плацента имела нормальный уровень метилирования, хотя по-прежнему была толще нормы.

Успех замены трофобласта макаки-резуса важен не только для клонирования, но и в целом для решения проблем с фертильностью в результате, например, нарушения имплантации или генетических расстройств, затрагивающих трофэктодерму.

Двенадцать удивительных клонов