Малая молекула компенсирует патогенный сплайсинг при боковом амиотрофическом склерозе

Боковой амиотрофический склероз (БАС) — это заболевание мотонейронов, при котором развивается слабость мышц и когнитивные нарушения. Частая причина БАС и деменции — наличие более 65 повторов последовательности нуклеотидов GGGGCC в первом интроне гена C9orf72 на девятой хромосоме. У здоровых людей повторов не более 30, и в процессе сплайсинга интрон 1 удаляется. Однако при транскрипции мРНК с мутантного участка нарушаются процессинг и трансляция, в результате синтезируются токсичные продукты, в том числе белки с дипептидными повторами.

Авторы статьи, опубликованной в журнале PNAS, описывают малую молекулу, которая специфично взаимодействует с удлиненной областью повторов в мРНК (ее обозначают r(G4C2)^exp) и предотвращает ее трансляцию.

Для экспериментов in vitro авторы брали у пациентов с БАС образцы ткани кожи и путем перепрограммирования получали индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), которые в дальнейшем дифференцировали в нейроны.

Анализ библиотеки малых молекул ReFRAME показал, что 69 кандидатов подходят для взаимодействия с такими повторами. Среди них авторы выбрали 16, физико-химические свойства которых могли им позволить пройти гематоэнцефалический барьер; наиболее эффективными оказались девять.

Для дальнейших исследований использовали модификацию одной из молекул, показавшую наилучшие результаты ингибирования трансляции и токсичности на клеточных линиях. Для оценки специфичного взаимодействия малой молекулы с мРНК авторы использовали разработанный ими метод Chem-CLIP, а также ASO-Bind-Map, который оценивает взаимодействие с мишенью за счет конкуренции между исследуемой малой молекулой и антисмысловым олигонуклеотидом (ASO).

При добавлении молекулы к клеточным культурам уменьшалось количество белка poly(GP) (это продукт аберрантной трансляции гена C9orf72, один из белков с дипептидными повторами, известный как маркер БАС). Кроме того, уменьшалось количество транскриптов с интроном 1 благодаря удачному сплайсингу. Соединение не было токсичным и не влияло на клеточную пролиферацию.

Авторы предположили, что ядерный рибонуклеопротеин Н (hnRNP H) также играет роль в развитии БАС: связывая область повтора, он препятствует сплайсингу интрона. Нокдаун гена hnRNP H подтвердил эту гипотезу. Авторы показали, что выбранная ими малая молекула замещает hnRNP H на шпильке, образованной участком с повторами, и при этом нормализуется сплайсинг.

Эксперименты in vivo на трансгенных мышах c9ALS/FTD продемонстрировали, что инъекции малой молекулы в течение двух недель снижают количество токсичных белков poly(GP) и poly(GA) в тканях мозга, как и количество интрона 1 в составе мРНК. Также у животных уменьшились поведенческие симптомы заболевания.

«Мы впервые показали, что можно создать проникающие в мозг молекулы, которые устраняют токсичные генные продукты. Тот факт, что мы применили это при БАС, показывает, что таким может быть общий подход к другим неврологическим заболеваниям, включая болезнь Хантингтона, формы мышечной дистрофии и другие», — говорит ведущий автор работы Мэтью Дисней (Университет штата Флорида).