МД-2021, день 1. Генетические технологии в репродуктивной медицине

С докладом «Геномные исследования эмбрионов и эндометрия в репродуктивной медицине» выступил Андрес Сулеметс из Центра компетенций технологий здравоохранения в Тарту (Эстония). Одно из направлений его работы — изучение состояния имплантационной готовности эндометрия. Выбор момента имплантации при искусственном оплодотворении — важнейший аспект, который определяет, приживется ли эмбрион и наступит ли беременность. Андрес рассказал о выявлении маркеров имплантационной готовности. «Окно имплантации» довольно узкое по времени — всего 48 часов через 6-8 дней после овуляции. Уже в 90-е годы стало понятно, что вряд ли существует единичный маркер в эндометрии, определяющий имплантационную готовность, и внимание ученых переключилось на омиксные подходы: изучение эпигенома, метилома и микроРНК. Андрес Сулеметс с коллегами обратились к РНК-секвенированию единичных клеток эндометрия.

Примерно у 30% женщин окно имплантации смещено по времени по сравнению с усредненными значениями. Для женщин с неудачными попытками имплантации существуют тесты на имплантационную готовность. Андрес Сулеметс рассказал, что они в сотрудничестве с Каролинским институтом в 2018 году создали тест beREADY на основе РНК-секвенирования единичных клеток эндометрия, который сейчас применяется в более чем 20 клиниках в Европе, включая российские.

Докладчик также упомянул исследование, в котором они с коллегами выяснили, что на вероятность успешной беременности влияет состав микробиоты эндометрия.

Последняя часть доклада была посвящена изучению мозаицизма у эмбрионов после искусственного оплодотворения. По сравнению с естественным оплодотворением у таких эмбрионов значительно повышена хромосомная нестабильность на ранних стадиях, но у рожденных детей нет разницы в уровне мозаицизма. Андрес и коллеги установили, что чаще, чем у эмбриона, мозаицизм наблюдается только в плаценте и элиминируется у эмбриона.

Игорь Лебедев, руководитель Лаборатории цитогенетики Томского НМИЦ, рассказал о преимплантационном генетическом тестировании хромосомных болезней. Неинвазивное преимплантационное тестирование (НИПТ) очень привлекательно, так как взятие пробы абсолютно не воздействует на эмбрион. Однако в ходе работы, выполненной в коллаборации с предыдущим докладчиком, удалось выяснить, что свободно циркулирующая ДНК лишь на 40% отражает состояние внутренней клеточной массы эмбриона, что ставит под вопрос расширение возможностей НИПТ.

Тесты ПГТ-А сейчас позволяют выявлять не только случаи анеуплоидии или хромосомных нарушений, но и случаи мозаичности эмбрионов. Как и предыдущий докладчик, Игорь Лебедев отметил, что мозаичные эмбрионы уже не считаются полностью непригодными к имплантации. В некоторых случаях имплантация мозаичного эмбриона может быть единственным выходом для родителей. В недавнем исследовании при имплантации такого эмбриона (с информированного согласия родителей) было зафиксировано 6 успешных вынашиваний. Сейчас важно сформулировать правила, определяющие, какие именно мозаичные эмбрионы подходят для имплантации.

По данным, полученным в США, вероятность успешной беременности и рождения ребёнка у здоровых родителей неожиданно оказалась выше в группе, где не проводилось тестирование на анеуплоидию, по сравнению с группой, где оно проводилось. Таким образом, риски от взятия материала для теста неоправданно высоки в случае здоровых молодых родителей, но в случае немолодых родителей тест полезен.

Игорь Лебедев также отметил, что возможна успешная детекция унаследованных хромосомных микроделеций размером до 300 кб комбинацией методов ПГТ-М и ПГТ-А, но по-прежнему остаются проблемой для тестирования микроделеции, возникающие de novo.

Андрей Глотов, заведующий медико-генетическим центром НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта (Санкт-Петербург) рассказал о современной идеологии генетических исследований репродуктивного здоровья на всех стадиях, от планирования беременности до взросления ребенка. Он подчеркнул, что в настоящее время генетические карты здоровья становятся омиксными и могут существовать в трех вариантах: преконцепционный скрининг (на гетерозиготное носительство моногенных заболеваний, рекомендован для всех супружеских пар), карта репродуктивного здоровья семьи (при проблемах с зачатием или вынашиванием) и карта общего здоровья семьи.

Помимо геномных данных, в генетических исследованиях репродуктивного здоровья постепенно начинают применяться другие омиксные данные — от транскриптомов до микробиомов. В России необходимо шире распространять преконцепционный скрининг при планировании беременности, отметил в заключение докладчик.

Йоханнес Чи-Юн Чин (компания Agena Bioscience), рассказал об использовании неинвазивного пренатального теста MassArray, основанного на масс-спектрометрии. Технология позволяет детектировать однонуклеотидные замены за счет разницы масс нуклеотидов. Для неинвазивного теста используется плазма крови матери, и лишь 10% свободно циркулирующей ДНК в ней представляет собой ДНК плода. Решением этой проблемы стало использование ферментов рестрикции, не способных к расщеплению метилированных участков ДНК. Полученный после обработки образец обогащен фрагментами ДНК, специфично гиперметилированных в ДНК эмбриона. С помощью MassArray также проводят кариотипирование — выявление трисомий по хромосомам 21, 18, 13. Например, для хромосомы 21 чувствительность теста составила 99%, специфичность — 94%.

Доклад Натальи Либман из компании First Genetics был посвящен факторам, которые влияют на разрешающую способность и качество ПГТ-А. ПГТ-А — это скрининг в цикле ЭКО для отбора эмбрионов без хромосомных аномалий. Для теста отбирают 5-10 клеток и далее проводят полногеномную амплификацию. На результаты влияет как человеческий фактор при интерпретации результатов, так качество исходного материала и технические особенности NGS-платформы. Более подробно докладчица остановилась на опыте использования в компании платформы ReproSeq. Несмотря на заявленную разрешающую способность в 5-10 Мб, при оптимальном качестве биоматериала возможно достичь разрешения в 2,5 Мб. Рекомендованных производителем 100 000 прочтений достаточно, и повышение их числа не увеличило разрешения, а вот снижение числа прочтений до 50 000 влияет на качество анализа. В заключение Наталья Либман сообщила, что First Genetics выпустила брошюру по особенностям проведения ПГТ-А.

Полина Козюлина (НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта) рассказала о попытках более глубокого биоинформатического анализа данных, полученных при проведении НИПТ для выявления хромосомных аномалий. Секвенирование при НИПТ охватывает около 20% генома с покрытием 1-2. А вот покрытие митохондриальной ДНК значительно выше — до 40. Несмотря на это, выявление митохондриальных генетических заболеваний по этим данным вряд ли возможно, заключила докладчица.

Заключительным в секции был доклад Елены Набиевой из лаборатории Георгия Базыкина (Сколково) о роли точечных мутаций и унаследованных генетических вариантов в ранней потере беременности. Докладчица рассказала о результатах проекта по секвенированию экзомов матери, отца и эмбриона при ранней потере беременности. Средний возраст эмбриона составил 13 недель. В проекте участвовали пары, у которых первичное тестирование не выявило хромосомных аномалий плода. Исследователи обращали внимание на de novo мутации у плода и на передачу двух мутированных копий гена от гетерозиготных родителей. В результате биоинформатики выявили примерно одинаковое количество случаев de novo мутаций и объединения двух гетерозиготных копий в различных генах.

Три случая Елена Набиева рассмотрела подробнее. У одного эмбриона сроком 6-7 недель выявили сдвиг рамки в гене DLL4. Этот ген участвует в ангиогенезе, нейрогенезе и, вероятно, нарушения в нем летальны. Во втором случае у плода выявили 6 de novo миссенс-мутаций, среди них ученые считают принципиальной мутацию в гене RYK. В третьем случае потеря беременности произошла на сроке 18 недель и, вероятнее всего, была связана с объединением двух нарушенных копий гена KIF26A. Елена Набиева подчеркнула, что эти выводы являются лишь научными догадками. Тем не менее, накопление таких знаний расширяет наши знания о возможных причинах потери беременности.

Информация о докладчиках

Андрес Сулеметс, Центр компетенций технологий здравоохранения, Тарту, Эстония

Игорь Николаевич Лебедев, д.б.н., профессор РАН, и.о. заместителя директора по научной работе Томского НМИЦ, руководитель лаборатории цитогенетики

Андрей Сергеевич Глотов, д.б.н. заведующий медико-генетическим центром ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург

Йоханнес Чи-Юн Чин, Agena Bioscience

Наталья Олеговна Либман, АО «First Genetics».

Полина Юрьевна Козюлина, ФБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург.

Елена Рашитовна Набиева, PhD, Сколковский институт науки и технологий, ИППИ им. А.А. Харкевича РАН, Москва.