МД-2021, день 3. Новейшие разработки в области NGS

Приборы для массового параллельного секвенирования от российских и зарубежных производителей, технологии поиска онкогенных мутаций и генотипов главного комплекса гистосовместимости, а также метод поиска однонуклеотидных замен в нормальных стареющих клетках.

Credit:
123rf.com

Отечественные технологии массового параллельного секвенирования на секции представил Яков Алексеев — директор по науке и один из основателей компании «Синтол», где был разработан российский секвенатор «Нанофор 05». (См. интервью с Яковом Алексеевым на PCR.NEWS.) Рынок секвенирования — как продуктов, так и услуг — растет быстрее, чем рынок фастфуда, и скоро его догонит, отметил докладчик. Численность сотрудников компании Thermo Fisher на 2018 год составляла около 70 000 человек; для сравнения, в России всего около 250 тысяч научных работников. Тем не менее каждой стране нужны собственные приборы для секвенирования.

Яков Алексеев рассказал о характеристиках «Нанофора 05», о роли, которую он сыграл в секвенировании геномов коронавируса во время пандемии. В 2020 году завершены госиспытания полногеномного секвенатора «ДНК Нанофор СПС» для секвенирования путем синтеза (sequencing-by-synthesis). Докладчик назвал его аналогом MiSeq от Illumina и отметил, что в основе многих разработок «Иллюмины» лежат российские патенты, в частности, А.Б. Четверина (метод молекулярных колоний) и А.Д. Мирзабекова (пришивка).

«Нанофор СПС» способен прочитать до 10 млрд п. н. за запуск и полностью обеспечен отечественными расходными материалами. Во время госиспытаний на нем секвенировали геном туберкулезной палочки. Результаты был хуже, чем у приборов Illumina, но за год удалось добиться улучшения.

После 2015 года падение цен на секвенирование замедлилось. Вернуть тенденцию на снижение могут новые технологии, такие как одномолекулярное секвенирование компаний Oxford Nanopore и Pacific Biosciences. Технологии PacBio, основанные на оптическом детектировании единичных молекул, отличаются высокой точностью. Сейчас «Синтол» по гранту Миннауки разрабатывают оптический одномолекулярный секвенатор совместно с троицким Институтом спектроскопии, Физтехом и биоинформатиками из Новосибирска.

О технологии секвенирования путем синтеза от Illumina подробнее рассказал в следующем докладе Игорь Шаповалов (компания «Альбиоген», Москва). «Альбиоген» входит в группу компаний «Р-Фарм» и является официальным дистрибьютором Illumina. Сейчас в мире работают более 17 тысяч приборов этой компании, в России и СНГ более 250.

Технологию sequencing-by-synthesis разработала компания Solexa в 1998 году, в 2004 году ее дополнило создание молекулярных кластеров. В 2006 году Solexa выпустила первый прибор Genome Analyzer, что было прорывом в секвенировании. «Иллюмина» купила «Солексу» в 2007 году и продолжила развитие технологии. Сегодня Genome Analyzer по производительности сравним с настольным секвенатором iSeq, а NovaSeq превосходит его в тысячи раз.

Докладчик рассказал об эволюции детекции, переходе от четырехканальной химии к двухканальной и даже одноканальной (iSeq). Случайное расположение молекулярных кластеров сменилось упорядоченным, причем, например, для NextSeq 2000 плотность данных выросла в 5 раз. В линейке сосуществуют старые и новые варианты детекции и кластеризации. Появляется новое более технологичное оборудование: коротковолновые лазеры, сверхразрешающая оптика, дегазирование реактивов, полупроводниковые детекторы сигнала, картриджи с интегрированной флюидикой. Работа с прибором становится проще, при этом качество данных остается бескомпромиссным.

Приборы Illumina находят все больше применений в современной медицине. Секвенатор MiSeqDx, разработанный специально для клинических лабораторий, уже получил российское регистрационное удостоверение как медицинское изделие; в настоящее время регистрируются панели реагентов.

Затем Игорь Шаповалов рассказал о приборе NextSeq 2000, объединившем все новые технологии компании. Этот прибор подходит для секвенирования экзомов, транскриптомов, таргетного секвенирования с обогащением, профилирования единичных клеток. NovaSeq 6000 ― секвенатор ультрапроизводительного сегмента, причем широкая линейка наборов позволяет варьировать производительность. Платформа DRAGEN обеспечивает сверхбыструю обработку данных. Она встроена в NextSeq, но ей также можно пользоваться на сервере либо в облачном сервисе Illumina.

Игорь Шаповалов напомнил, что Illumina обычно сообщает о своих новинках в январе, и, возможно, так будет и в 2022 году.

Сравнительно новый игрок на рынке секвенирования — китайская группа компаний BGI, ранее известная как Beijing Genomics Institute. В марте 2013 года BGI поглотила калифорнийскую компанию Complete Genomics. Дочерняя компания BGI — MGI Tech — в 2018 году вышла на рынок с приборами на основе технологии DNBSEQ, разработанной Complete Genomics. В чем особенности этой технологии, объяснил Дмитрий Хачин (компания «Хеликон», Москва).

Библиотеки для секвенирования DNBSEQ подготавливаются без ПЦР: меченый фрагмент денатурируется, замыкается в колечко, и после репликации «катящегося кольца» образуется клубок ДНК (DNA NanoBall, отсюда аббревиатура).

Этот наноклубок — по сути, аналог кластера в технологии «Иллюмины», но его получают в пробирке, до загрузки на ячейку, и это позволяет проверить библиотеку перед запуском синтеза. В отличие от ПЦР, при DNBSEQ не происходит накопление ошибок в циклах (матрица всегда одна и та же), поэтому, например, при поиске замен в геноме не будет ложноположительных результатов. Также исключаются некорректная количественная оценка исходного соотношения фрагментов и неравномерность покрытия из-за разного нуклеотидного состава тех или иных участков. В регуляризованной проточной ячейке два клубка не могут сесть рядом, поэтому ячейку нельзя перегрузить. Для секвенирования используется технология cPAS (combinatorial probe anchor synthesis), которая обеспечивает высокую скорость и четкость.

Производительность приборов достаточно высока, есть возможность получения длинных ридов (с применением специальных реагентов) и генерации файлов FASTQ прямо на секвенаторе, в офлайн-режиме. Существует простой протокол трансформации библиотек Illumina в библиотеки для DNBSEQ. Еще один немаловажный фактор для РФ — поскольку компания китайская, нет риска прекращения поставок из-за санкций. Среди приложений технологии — полногеномное и полноэкзомное секвенирование, таргетное секвенирование, транскриптомы.

В РФ первый прибор от MGI появился в 2019 году. Сейчас уже ясно, что технология рабочая, она используется в разных лабораториях под разные задачи. Наиболее проработано экзомное секвенирование. Приборы используются в репродуктивной генетике, для полногеномного секвенирования коронавируса. В начале будущего года ожидается новый секвенатор меньшего размера.

О новых технологиях Roche для клинических исследований рассказала Ирина Карпова (ООО «Рош Диагностика Рус», Москва). В портфолио компании много продуктов для пробоподготовки. На этой неделе появилась новая технология для таргетного обогащения KAPA HyperPETE (primer extention target enrichment). Ее отличает быстрота и возможность автоматизации. Технология сохраняет производительность традиционной гибридизации, обеспечивая при этом более эффективный рабочий процесс. Она валидирована для обнаружения всех основных соматических вариантов в свободно циркулирующей ДНК, образцах FFPE и РНК, включая SNV, короткие инделы, CNV, MSI и фьюжены, то есть гибридные транскрипты (как новые, так и известные), и особенно подходит для небольших панелей онкологических исследований.

KAPA HyperPETE сравнима с якорной мультиплексной ПЦР (anchored multiplex PCR, AMP), но при необходимости захвата протяженных фрагментов обработка легче, сиквенс более однородный. Легче выполняется обработка небольшого количества образцов. Высокая однородность покрытия достигается за счет использования праймеров, которые не надо обрезать в процессе анализа данных, пояснила докладчица.

Портфолио продукта включает готовые панели и кастомные панели трех групп: для создания стандартных дизайнов, для нестандартных дизайнов и для анализа фьюженов. Есть панели на наследственную и соматическую онкологию и для скрининга новорожденных, а также две панели для выявления мутаций в свободно циркулирующей ДНК — Hot Spot и Pan Cancer.

С онлайн-докладом о современных методах анализа иммунного ответа при COVID-19 выступила Агнешка Цесельска (компания 10хGenomics). COVID-19 — сложное заболевание, которое требует холистического подхода; усредненные результаты не ведут к пониманию. Инструменты для современных молекулярных исследований единичных клеток предлагает 10хGenomics (подробнее об этом на PCR.NEWS). Докладчица сравнила технологии 10хGenomics с «молекулярным микроскопом», который позволяет исследовать геномы и транскриптомы отдельных клеток. Так, информацию об иммунном профиле клетки иммунной системы получают с помощью наборов для изучения экспрессии генов и V(D)J-регионов единичных клеток.

С помощью таких методов можно, например, сравнить образцы крови здоровых людей, больных коронавирусной инфекцией или гриппом, и увидеть, чем различается иммунный ответ на тот и другой вирус и почему COVID-19 опаснее для пожилых людей. Можно детектировать, в каких органах и тканях имеются «входные двери» для коронавируса — рецепторы АСЕ2. Так, они есть на перицитах сердца, и у людей с сердечным заболеваниям этих рецепторов больше — это дополнительный фактор риска. Исследование единичных клеток дает более глубокое понимание адаптивного иммунного ответа, необходимое, чтобы понять и выработать стратегию вакцинации, подчеркнула Агнешка Цесельска.

Технологии 10хGenomics могут быть полезны для поиска эффективных нейтрализующих антител против коронавируса. С их помощью можно изучать клеточный репертуар выздоравливающих пациентов, следить за эволюцией В-клеточного иммунного ответа, и за несколько недель находить самые представленные клоны, с самой высокой нейтрализующей активностью. Аналогичным образом исследуют и реакцию на прививку: так. в Университете Вандербильта проследили динамику клеточного ответа до 42-го дня после прививки мРНК-вакциной компании Pfizer.

Александр Маслов (Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Нью-Йорк, США) рассказал об интересной альтернативе секвенированию единичных клеток для поиска соматических мутаций, сопровождающих старение организма. В стареющих клетках накапливаются мутации, которые нарушают их функции и в конечном счете приводят к старению организма — это утверждение кажется общим местом, но проверить его на практике довольно трудно. Есть наблюдения на животных, но для исследования человека нужны методы детекции мутационной нагрузки в нормальных тканях.

Инструмент для этого дало развитие NGS. Кажется, что легко отсеквенировать клетки и сравнить с референсом. Но есть проблема: соматические мутации выглядят так же, как ошибки секвенирования. Ян Вайг и Александр Маслов с коллегами несколько лет назад разработали такую технологию секвенирования единичных клеток, которая позволяет обойти эту проблему, и действительно увидели экспоненциальное накопление мутаций с возрастом.

Однако секвенирование единичных клеток трудоемко и дорого. Если предположить, что полное секвенирование генома одной клетки стоит 600 долларов, и умножить на количество клеток, становится ясно, что такое исследование приемлемо для фундаментальной науки, но не для скрининга многих индивидов. Нужен более высокопроизводительный метод анализа мутационной нагрузки в тканях человека.

Для уменьшения ошибок чтения был предложен метод под названием Duplex Seq — параллельный анализ обеих цепей ДНК. Истинные мутации обнаруживаются в одном и том же положении в обеих цепях, в отличие от ошибок секвенирования, амплификации или повреждений ДНК. Но недостатком этого метода был очень низкий уровень утилизации данных секвенирования. Парные цепочки разлучаются на первом этапе подготовки библиотек, и потом пары трудно найти. Этого недостатка лишен метод, разработанный Масловым с коллегами — single molecule mutation sequencing (SMM seq) при котором физическую связь между цепочками обеспечивает адаптор в виде шпильки. На следующем этапе конструкция подвергается линейной амплификации, две цепочки амплифицируются параллельно, и невозможна ситуация, когда одна из цепочек теряется.

Когда нормальные клетки бронхиального эпителия человека обработали реагентом, вызывающим точечные мутации, обнаружили надежнуюб корреляцию между воздействием и ростом числа замен А на Т, характерных для этого мутагена. Также подтвердили рост мутационной нагрузки в клетках печени человека — те же образцы были перед этим проанализированы методом секвенирования единичных клеток. Нашли и корреляцию с возрастом, и хорошее соответствие данных SMM-seq и single cell seq.

Метод секвенирования единичных клеток остается золотым стандартом при поиске однонуклеотидных вариаций в нормальных клетках, подчеркнул докладчик, но более простые методы SMM seq предлагают лучшее соотношение цена-качество. Нужно развивать новое поколения методов, не только для точечных, но и для других типов мутаций, таких как инсерции и делеции, структурные перестройки и др.

Андреас Полтен представил актуальные решения компании Agilent Technologies для молекулярной диагностики. Он отметил, что в борьбе с раком различные методы, появившиеся в последние годы, дополняют друг друга, и клиницисты имеют возможность выбора. Сегодня настало время полных геномов и экзомов в соматическим и клиническом контексте, добавил он.

Действительно значимых генов, ассоциированных с онкозаболеваниями, на первом уровне мало, 16–17. Но сейчас уже существуют панели на выявление панраковых маркеров, микросателлитной нестабильности (важный фактор при раке ободочной кишки), опухолевой мутационной нагрузки. Анализ генов позволяет вывяить кандидатов на терапию теми или иными препаратами. Например, если анализ генов сочетать с фенотипическим анализом, можно не только обнаружить мутацию в BRCA, но и определить, дефектен ли соответствующий сигнальный путь, и при необходимости выбрать другой сигнальный путь в качестве мишени.

Андреас Полтен рассказал о процессе контроля качества панелей, о протоколе SureSelect с таргетным обогащением для подготовки библиотек. Он подчеркнул, что для анализа ДНК и РНК используются одинаковые рабочие процессы, и это важно для будущей автоматизации, для которой у Agilent есть собственные платформы — Bravo и Magnis. Затем подробнее представил существующие панели и рассказал об их улучшениях.

Секцию завершил доклад Татьяны Янкевич (компания «ДНК-Технология», Москва) «Разработка системы для типирования генов системы HLA методом NGS. Опыт использования». HLA-типирование необходимо при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для лечения онкозаболеваний, иммунодефицитов и других состояний. В настоящее время типировано большое количество доноров, но многие на низком разрешении. Кроме того, генотипы HLA могут быть ассоциированы с развитием адаптивного иммунитета и чувствительностью к лекарственным препаратам. HLA-типирование применяется в репродуктивной биологии, например, для определения совместимости партнеров при многократном невынашивании беременности. При этом HLA — одна из самых полиморфных систем, для нее известны десятки тысяч вариантов.

Пока нет ясных требований к технологии типирования, отметила докладчица, поэтому они использовали требования Европейской федерации иммуногенетики для пересадки от неродственного донора. Типирование проводится в России по пяти локусам, за рубежом принято шесть. Фактически требованиям соответствует только секвенирование по Сенгеру и высокопроизводительное секвенирование.

Первый набор реагентов NGS для типирования генов HLA высокого разрешения, разработанный в «ДНК-технологии», — «HLA-эксперт» — был зарегистрирован в 2019 году. (Компания также предлагает тесты для типирования аллелей отдельных локусов методом ПЦР.) Есть два варианта набора, для ручного и автоматизированного анализа. имеется возможность пулировать индексированные образцы

Хотя последний год был тяжелый, но все же было типировано 828 образцов и по результатам проведено 3 донации, сообщила Татьяна Янкевич. Она рассказала о работе, где искали ассоциации генотипов HLA класса I с тяжестью COVID-19 и для типирования использовали «HLA-эксперт». Были и другие публикации, например, по влиянию генотипов HLA на сахарный диабет и ревматоидный артрит.

 

Информация о докладчиках

Яков Игоревич Алексеев, компания «Синтол», Москва

Игорь Сергеевич Шаповалов, компания «Альбиоген», Москва

Дмитрий Петрович Хачин, компания «Хеликон», Москва

Карпова Ирина Юрьевна, ООО «Рош Диагностика Рус», Москва

Агнешка Цесельска, компания 10хGenomics

Александр Юрьевич Маслов, медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Нью-Йорк, США

Андреас Полтен, компания Agilent Technologies

Татьяна Эдуардовна Янкевич, компания «ДНК-Технология», Москва

Добавить в избранное

Вам будет интересно