МД-2021, день 3. Молекулярные методы в трансфузиологии и трансплантологии

Заседание секции открыл профессор Евгений Жигбурт из НМХЦ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ. Он поприветствовал участников секции и представил первого докладчика: Наталью Минееву из Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России.

Наталья Минеева начала свой доклад с актуальности применения генотипирования для определения антигенов эритроцитов. Классическими методами, используемыми для этих целей, являются серологические исследования, однако они не всегда позволяют провести детальный скрининг антигенов эритроцитов перед трансфузией. Например, серологическими методами невозможно определить группу крови у реципиента в течение трех месяцев после переливания крови из-за присутствия смешанной популяции эритроцитов или провести анализ антигенов у онкобольных из-за снижения уровней их экспрессии.

Наталья Минеева отметила, что генотипирование также может облегчить подбор донора при наличии в крови реципиента некоторых антител, создающих риск неспецифического связывания с его эритроцитами. Его можно использовать для уточнения резус-статуса пациентов, который может быть затруднен, в частности, при наличии слабых и парциальных форм антигена D в крови у пациента. Последнее, по словам докладчика, особенно актуально для беременных женщин при тестах на резус-совместимость матери и плода.

Было проведено генотипирование 840 образцов крови доноров и реципиентов. Наталья Минеева представила несколько частных случаев генотипирования с целью уточнения резус-статуса пациентов, у которых наблюдалась смешанная картина. Она заключила, что этот метод имеет широкий потенциал для применения в трансфузиологии и позволяет проводить более точные исследования.

Следующий доклад был посвящен биомаркерам вирусного гепатита Е (ВГЕ) у доноров крови, его представила сотрудница компании «НПО Диагностические системы» Ирина Голубева. Основной способ передачи ВГЕ — фекально-оральный, однако в последнее время появляются данные о возможности его трансфузионной передачи.

Как отметила Ирина Голубева, гепатит Е не эндемичен для России, и исследования этого заболевания ведутся в нашей стране только с 2013 года. Однако многие другие страны уже ввели скрининг крови на гепатит Е для всего населения (Ирландия, Великобритания, Нидерланды и др.) или для групп риска, например, для доноров крови при переливании беременным женщинам (Франция, Австрия, Италия и др.).

В рамках исследовательской деятельности компании «НПО Диагностические системы» в 2018–2019 годах была проведена масштабная работа по выявлению антител IgG и IgM к вирусу гепатита Е в сыворотке крови 6000 доноров в возрасте от 18 до 67 лет из десяти регионов России. В среднем по России антитела IgM к ВГЕ были обнаружены у 2,5% доноров, а IgG — у 3,7%, причем в 13,4% случаев в сыворотке присутствовали оба типа антител. Это, по словам докладчика, может свидетельствовать о скрытом протекании острого гепатита Е. При этом в большинстве регионов антитела к ВГЕ чаще обнаруживались в сыворотке крови регулярных доноров, а не тех, кто пришел сдавать кровь впервые. В целом, по словам докладчика, наблюдаемые показатели серопревалентности населения России к ВГЕ совпадают с показателями для ряда европейских стран, и, возможно, для обеспечения безопасности донорской крови для реципиентов потребуется ввести хотя бы выборочный скрининг.

В следующем докладе Вера Белякова из Центра крови им. О.К. Гаврилова ДЗМ представила результаты, полученные в лаборатории обеспечения инфекционной безопасности компонентов крови и лаборатории HLA-типирования. Она начала свой доклад с краткого описания структуры и задач Центра, остановившись подробнее на методах лабораторного скрининга для определения инфекционной безопасности крови и ее компонентов. Молекулярно-биологические методы используются для определения нуклеиновых кислот вирусов из списка, закрепленного в законодательстве. Молекулярно-биологические методы определения маркеров возбудителей инфекций используются для их выявления в период так называемого серологического окна, когда организм уже заражен, но тесты на серологические маркеры дают отрицательный результат. За 11 лет работы было протестировано более 1,7 млн образцов крови, из которых в 111 образцах была обнаружена РНК вируса гепатита С, в 10 — ВИЧ и в 218 — ДНК гепатита В. Таким образом, на каждые 5000 потенциальных доноров приходится по одному с положительным ПЦР-тестом на вирусные нуклеиновые кислоты — это довольно высокий показатель по сравнению с другими странами.

Во второй части своего доклада Вера Белякова рассказала о практике применения генотипирования для определения антигенов эритроцитов в случае, когда группу крови не получается определить серологическими методами или при выявлении слабых вариантов антигенов. В лаборатории серологическими методами было протестировано более 80 тысяч образцов крови доноров и пациентов, из них 47 были дополнительно протестированы при помощи молекулярно-биологических методов, позволивших выявить ряд редких вариантов антигенов.

Более подробно вопросы HLA-типирования осветила в своем докладе Мария Логинова из Кировского НИИ гематологии и переливания крови. Она затронула тему формирования регистра доноров гемопоэтических стволовых клеток и рассказала об опыте разработки отечественной NGS тест-системы, совместимой с платформами Illumina и Thermo Fisher Scientific.

Сейчас в объединенном регистре потенциальных доноров ГСК для России и Казахстана около 110 тысяч человек — сравнительно небольшое число. Однако даже такой регистр позволил обеспечить более 600 трансфузий, то есть примерно каждый 200-й человек из регистра становится донором. Однако за все время существования регистра менялись многие параметры типирования, такие как число локусов и разрешение, поэтому данные доноров в нем достаточно неоднородны. Долгое время проведение HLA-типирования в соответствии с мировыми стандартами было затруднено из-за отсутствия отечественной тест-системы. Ее создание началось в 2018 году, в качестве индустриального партнера института выступила компания Parseq Lab. Разработанная система VariFind™ HLA Solution IL-v2 позволяла проводить типирование по пяти локусам (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1). Эта тест-система успешно прошла клинические испытания и получила регистрационное удостоверение в конце 2019 года.

Об изменениях в Положении о медицинских устройствах диагностики in vitro (In Vitro Diagnostic Medical Devices Regulation) рассказал Миша Нублинг из Института Пауля-Эрлиха в Германии. Новое Положение вступает в силу с 26 мая 2022 года. В настоящее время на территории Европейского союза действует Директива 98/79/EC, на основании которой государства-участники принимают законы об устройствах медицинской диагностики, что создает условия для более гибкой регуляции. Новое Положение вводит более жесткие нормы и стандарты, обязательные к выполнению.

Также Положение вводит классификацию средств in vitro диагностики по уровням риска для индивидуального и общественного здоровья, разделяя их на четыре класса (A-D), где A соответствует средствам, несущим наименьший риск для индивидуального и общественного здоровья. Проверка новых средств на соответствие необходимым требованиям будет проводиться в так называемых референсных лабораториях. Во второй части своего доклада Нублинг кратко рассказал об опыте оценки тестов на SARS-CoV-2, выполненной в его лаборатории по правительственному запросу.

Далее последовал доклад председателя секции Раузы Волковой. Она обозначила основные задачи, связанные с оценкой вирусной безопасности методом ПЦР при производстве препаратов крови. По ее словам, требования, предъявляемые российским законодательством в этой области, гармонизированы с международными. Валидация иммунохимических тестов проводится по специально разработанным руководствам, но для ПЦР-тестов таких руководств пока нет. Европейская фармакопея предполагает использование дополнительных стандартных образцов — положительных контролей.

Существует множество отечественных тест-систем для выявления нуклеиновых кислот различных вирусов в сыворотке крови пациентов, которые могут быть использованы для контроля сырья при производстве препаратов крови. Рауза Волкова представила результаты исследования отечественных тест-систем в соответствии с принципами европейской фармакопеи: с использованием дополнительных положительных контролей для соответствующих вирусов. В качестве объекта была использована донорская плазма крови, поступавшая из различных учреждений.

Ряд тест-систем показал достаточную эффективность при определении низких концентраций нуклеиновых кислот ВИЧ и вирусов гепатитов В и С, но для некоторых систем результаты оказались неожиданно плохими. Рауза Волкова представила результат проверки одной из отечественных тест-систем (докладчик ее не назвала) на положительных контрольных образцах из международной панели. Тест-система справилась с выявлением ДНК гепатита B, но выявить РНК ВИЧ и гепатита С с ее помощью не удалось. Таким образом, вопрос реальной чувствительности такой системы остается открытым.

Рауза Волкова подчеркнула необходимость использования дополнительных положительных контрольных образцов при проведении оценки инфекционной безопасности сырья для препаратов крови и разработки отечественной панели стандартных образцов для этих целей.

С заключительным докладом в секции выступил Евгений Жигбурт из НМХЦ им. Н.И. Пирогова. Он рассказал об общем состоянии дел в области трансфузиологии в России. К настоящему времени почти 1% населения страны получал донорскую кровь, и уровни заготовки материала на станциях переливания соответствуют этому запросу. В период пандемии SARS-CoV-2 хорошо оснащенные лаборатории молекулярной диагностики при станциях переливания крови оказались способны одними из первых перестроиться на обнаружение нового вируса. Растущее количество пациентов, которым необходимо переливание крови, приводит к возрастанию потребности в развитии методов генотипирования в трансфузиологии.

Законодательство, регулирующее переливание крови, было значительно переработано в последние годы. Стандарты, закрепленные в них, существенно отличаются от международных и, по мнению Евгения Жигбурта, нуждаются в пересмотре. Инфекционная безопасность крови является одной из важнейших проблем трансфузиологии и должна контролироваться более тщательно. Основной фактор риска — переливание плазмы, поэтому современные тенденции предполагают переход к переливанию отдельных компонентов крови и сокращению объемов переливаемой плазмы там, где это возможно.

Информация о выступающих: 

Минеева Наталья Викторовна, д.б.н. – Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России» (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России), Санкт-Петербург

Голубева Ирина Федоровна – Компания «НПО Диагностические системы», Нижний Новгород

Белякова Вера Владимировна, к.м.н. – ГБУЗ «Центр крови им. О.К. Гаврилова ДЗМ», Москва

Логинова Мария Александровна, д.б.н. – Кировский НИИ гематологии и переливания крови, Киров

Миша Нублинг, доктор, приват-доцент – Институт Пауля-Эрлиха, Ланген, Германия

Волкова Рауза Асхатовна – ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России

Жибурт Евгений Борисович, д.м.н., профессор – ФГБУ «НМХЦ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва