Молекулярная диагностика рака: особенности методов и проблемы трактовки результатов

Первый доклад представил к. м. н, доцент Дмитрий Михайленко, сотрудник Медико-генетического научного центра им. Академика Н.П. Бочкова и Сеченовского Университета. Он отметил, что до сих пор не все врачи осознают преимущества генетической диагностики.

Дмитрий Михайленко рассказал о направлениях применения генетической диагностики в онкологии. Это идентификация герминальных мутаций для подтверждения наследственных онкологических синдромов (НОС); выявление мутаций и генетических вариантов, влияющих на эффективность химио- и таргетных терапий; определение экспрессионных профилей для оценки прогноза заболевания. Михайленко обозначил предметы генетической диагностики — гены, в которых произошла активирующая мутация, приведшая к развитию опухоли, и гены-супрессоры, в нормальном состоянии блокирующие развитие опухоли, которые могут инактивироваться в результате мутации. В качестве клинического материала для диагностики используются кровь из вены и фиксированные ткани, полученные при биопсии.

Так как в большинстве случаев генетический анализ используется для подтверждения НОС, существуют критерии, которые позволяют врачу-онкологу заподозрить наличие синдрома. К таким критериям относятся, например, манифестация заболевания в раннем возрасте, возникновение опухолей у большого числа родственников, а также специфичные характеристики опухоли.

В качестве примера наследственного заболевания Дмитрий Михайленко привел VHL-синдром, отметив, что при интерпретации результатов секвенирования часто возникают проблемы, так как для большого количества мутаций отсутствуют аннотации или не определена клиническая значимость.

Также Михайленко описал критерии выбора NGS как метода диагностики НОС. По его словам, NGS целесообразно применять в случаях, когда ген-кандидат протяженный, без мажорных (высокочастотных) мутаций, генов-кандидатов несколько или же клиническая картина не соответствует распространенным НОС. В остальных же случаях достаточно аллель-специфического ПЦР-анализа или секвенирования по Сэнгеру.

Хотя в большинстве случаев соматические мутации при спорадических опухолях выявляются рутинными методами, в некоторых случаях имеет смысл использовать NGS, например, если пациент собирается выехать в страну, где возможно применение препаратов офф-лейбл или для оценки мутационной нагрузки.

В завершение доклада, Дмитрий Михайленко сделал небольшой обзор наиболее часто применяемых диагностических систем генетического анализа.

Доклад «Наследственные и спорадические онкологические заболевания органов желудочно-кишечного тракта» представил Алексей Цуканов, заведующий отделом молекулярной генетики НМИЦ колопроктологии им. А.Н. Рыжих.

Алексей Цуканов начал свой доклад со статистики. В 2020 году в России было выявлено 234,3 злокачественных образования на 100 000 человек. Из них 25% — опухоли органов ЖКТ, и 3–5% обусловлены наследственной предрасположенностью.

Цуканов отметил, что генетические исследования наследственных опухолей позволяют не только правильно выстроить программу лечения пациента, но и сформировать группу риска среди родственников — носителей мутации.

Продолжая доклад Михайленко, Алексей Цуканов еще раз обратил внимание на важность критериев клинического отбора пациентов. В качестве иллюстрации он привел наиболее распространенный среди европейцев НОС — синдром Линча, вызываемый мутациями в генах системы репарации ДНК. Критерии первичного отбора пациентов с синдромом Линча, основанные на клинической картине, так называемые Амстердамские критерии, были предложены еще в 1991 году. Их чувствительность составляла всего 22% при специфичности 98%. В 2004 году к Амстердамским критериям была добавлена микросателлитная нестабильность, что позволило повысить чувствительность до 82%. Дальнейшие модификации критериев отбора были разработаны уже группой Алексея Цуканова. Они включают возникновение колоректального рака у пациентов в возрасте до 43 лет и развитие еще двух или более опухолей любой локализации у пациента или его кровных родственников. Критерии группы Цуканова позволяют добиться чувствительности в 88–100% и активно используются в России в настоящее время.

Алексей Цуканов также отметил, что при диагностике НОС рационально в первую очередь использовать панели, направленные на наиболее распространенные мутации, связанные с конкретным синдромом, и только потом переходить к расширенным методам анализа.

Во второй части доклада Алексей Цуканов рассказал об особенностях лечения рака органов ЖКТ, а также привел список основных генетических маркеров для диагностики различных опухолей органов ЖКТ и препаратов, используемых для их лечения.

Следующий спикер, Петр Никифорович, сотрудник НМИЦ эндокринологии Минздрава России, представил доклад «Практические аспекты молекулярно-генетической диагностики в онкоэндокринологии».

Петр Никифорович сосредоточился на мутациях BRAF и TERT, ассоциированных с раком щитовидной железы. При проявлении в тандеме эти мутации вызывают резкое снижение выживаемости. В настоящее время мутация BRAF используется, в основном, для валидации данных цитологического исследования, так как присутствует корреляция между наличием мутации и морфологией опухоли. Никифорович отметил, что при наличии нескольких очагов рака каждый из них может иметь уникальный генетический профиль.

Никифорович рассказал, что в данный момент ведется работа над стандартизацией использования мутаций в качестве маркеров для таргетной терапии. Успешный пример такого использования — введенный в 2020 году анализ мутаций в гене BRAF у пациентов при неоднозначном диагнозе. Такой анализ позволяет избежать излишних операций и удаления фрагментов щитовидной железы для проведения гистологического анализа.

Важна также и мутационная нагрузка. Так, наиболее опасный рак щитовидной железы — анапластический, который характеризуется наибольшим количеством мутаций, до 2020 года не поддавался лечению в принципе. Однако выявление мутации BRAF позволило проводить таргетную терапию, которая снижает размер опухоли до операбельного.

Далее Петр Никифорович кратко рассказал о различных видах рака щитовидной железы и методах их диагностики и лечения.

В завершение доклада Никифорович отметил, что для эффективного процесса диагностики и лечения онкологических заболеваний необходимо налаживание взаимодействия между генетиками и врачами-клиницистами.

Во время дискуссии после доклада Никифорович также заметил, что методы генетической диагностики необходимо создавать таким образом, чтобы врач-онколог мог понятно и легко донести результаты до пациента. Также необходимо проведение обучающих курсов по методам генетической диагностики для онкологов.

Следующий доклад — «Особенности диагностики онкозаболеваний с применением высокопроизводительного секвенирования и интерпретация его результатов» — представила н. с. лаборатории эпигенетики Медико-генетического научного центра Кристина Карандашева.

В начале своего доклада Кристина Карандашева напомнила, что объектом генетического исследования может быть как геном пациента, так и геном опухоли, и что наилучшие результаты достигаются при одновременном исследовании двух объектов, так как это позволяет более точно выявить соматические мутации и отделить их от генетических вариантов здоровой ткани.

Далее Карандашева обозначила несколько важных моментов, которые необходимо учитывать при проведении исследований. Так, например, материал, заключенный в парафиновые блоки, непригоден для исследований РНК из-за деградации последней. Также необходимо помнить, что опухоль — это динамически изменяющаяся гетерогенная система, а значит результаты секвенирования зависят как от топологии взятой ткани, так и от времени забора образца.

Карандашева также отметила, что генетические изменения в опухолевых тканях не ограничиваются только SNP. Так, немелкоклеточный рак легкого значительно изменяет кариотип клеток. При этом современные технологии секвенирования часто не способны уловить такой тип изменений.

В следующей части доклада Кристина Карандашева рассказала про различия методов секвенирования в зависимости по длине прочтения. Так, системы, выдающие короткие прочтения, отличаются большей точностью и пригодны для поиска SNP и коротких инделов. Приборам, генерирующим длинные прочтения, свойственна меньшая точность, но они способны анализировать повторы и длинные инделы.

Карандашева также осветила различия методов по ширине исследования. Таргетное секвенирование и анализ экзома отличаются простотой интерпретации результатов, в то время как при полногеномном секвенировании встает проблема аннотации мутаций. Таргетное секвенирование также имеет наибольшую глубину покрытия, т. е. захватывает максимальное количество различных генетических вариантов, присутствующих в опухоли. Однако применение таргетных панелей позволяет провести анализ только тех генов, которые присутствуют в панели. По мнению Кристины Карандашевой, на данный момент оптимальны большие (400–500 генов) генные панели, занимающие среднее положение между таргетным секвенированием и анализом экзома.

Помимо прочего, Карандашева рассказала о протоколе анализа данных NGS, поиске соматических вариантов с малой представленностью и аннотацию генетических вариантов.

В конце доклада Кристина Карандашева привела список ПО и баз данных для анализа результатов NGS.

Во время дискуссии после доклада Кристина Карандашева высказалась о сложности интерпретации генетических вариантов с неопределенной клинической значимостью и о том, что пациент должен получать результаты секвенирования на руки, чтобы их можно было перепроверить в другой лаборатории.

Следующий спикер, директор ООО «Онкодиагностика Атлас» Владислав Милейко, представил доклад «Генетическая диагностика онкологических синдромов, обусловленных мутациями BRCA1/2».

Перед началом доклада Милейко подвел итог предыдущему обсуждению: «И практика показывает, и здравый смысл подсказывает, что перекладывать ответственность интерпретации вариантов на клиницистов — это просто проигрышная стратегия».

BRCA — ген, ассоциированный с раком молочной железы. Владислав Милейко начал доклад со статистики. Исследования в Новосибирской области показали, что у 1 из 330 россиян есть мутация в BRCA1/2 (частоты различаются по популяциям). Данные исследований в США говорят о том, что генетическое тестирование на мутации в BRCA1/2 прошло в 10 меньше мужчин, чем женщин. При этом мутации BRCA1/2 повышают, в том числе, риск развития рака предстательной и поджелудочной желез.

Далее Владислав Милейко отметил, что отдельные мутации вносят различный вклад в клинические проявления синдрома, в связи с чем кажется, что для получения исчерпывающего теста необходимо расширение тестовых панелей. По мнению докладчика, для решения этой проблемы, необходимо найти некоторый баланс между диагностической информативностью и однозначностью интерпретации результатов.

В следующей части доклада Владислав Милейко обратил внимание на то, что выживаемость пациентов, протестированных до постановки диагноза, гораздо выше, чем у пациентов, протестированных уже после обнаружения рака. В связи с этим встает вопрос о целесообразности массового тестирования. Ссылаясь на зарубежные исследования, Милейко отметил, что при достижении определенной стоимости теста (разной для разных стран) массовое тестирование становится экономически выгодным для системы здравоохранения.

Далее Владислав Милейко рассказал о доступных методах тестирования и сравнил эффективность и целесообразность ПЦР- и NGS-тестов, а также рассмотрел различные рекомендации по тестированию здоровых людей в зависимости от факторов риска.

В финале доклада Милейко рассказал об участии в разработке и регистрации первого в России онкологического NGS-теста, и разобрал, какими свойствами должны обладать NGS-тесты для онкологии. Отдельно докладчик отметил необходимость максимальной простоты исполнения тестов и важность защиты от кросс-контаминации.

Последний доклад вебинара, «Организационно-финансовые аспекты проведения генетических лабораторных тестов при онкологических заболеваниях», представила руководитель лаборатории молекулярной биологии Городской онкологической больницы №62 Депздрава Москвы Ирина Демидова.

В начале доклада Ирина Демидова отметила важность наличия молекулярной лаборатории в онкологической клинике и необходимость работы лаборатории в постоянном контакте с другими отделениями и врачами.

Разговор о финансовых аспектах начался с рассказа о том, какие генетические тесты, проводимые их лабораторией, доступны по ОМС. Демидова отметила резкий рост востребованность генетических анализов в 2019 году с приходом в индустрию государственного финансирования.

Далее Ирина Демидова рассказала о федеральном проекте «Борьба с онкологическими заболеваниями» и некоторых его особенностях, а также о сложностях стандартизации генетического тестирования на государственном уровне. Так, в программе госгарантий, само понятие отдельного «теста» нигде официально не определено, используется выражение «проведение молекулярно-генетического исследования», которое во всех регионах трактуется по-разному.

В следующей части доклада Ирина Демидова провела обзор уже принятых и планируемых изменений в финансировании отрасли в 2021 году. Она отметила проблему поиска квалифицированных кадров для лабораторий.

Затем Демидова рассказала о процедуре внесения исследований в ОМС. В 2019 году в Москве в тарифное соглашение МГФОМС были введены исследования для определения возможностей таргетной терапии. В июле 2020 года удалось ввести в тарифное соглашение исследование мутаций BRCA1/2 методом NGS. После включения исследований в ОМС количество проводимых тестов значительно возросло.

В заключение Ирина Демидова отметила необходимость дальнейшего увеличения доступности генетических исследований.

Завершая вебинар, Дмитрий Михайленко поблагодарил всех участников и еще раз подчеркнул необходимость создания площадок для консультации врачей и пациентов по результатам тестов NGS.

ПРОГРАММА ВЕБИНАРА