На основе системы CRISPR/Cas9 разработан способ управления наследованием аллелей у мышей

В системе редактирования генома, примененной на дрозофилах и малярийных комарах, использовалась гидовая РНК, соответствующая одному из аллелей, и нужная последовательность, на которую в итоге будет заменен этот аллель. Гидовая РНК управляет эндонуклеазой Cas9, которая делает двухцепочечный разрыв в заменяемом аллеле, после чего целостность хромосомы восстанавливается в ходе гомологичной репарации. В итоге нужный аллель заменяется аллелем из гомологичной хромосомы, и гетерозигота становится гомозиготой.

Однако в соматических клетках млекопитающих преобладающим способом репарации двухцепочечных разрывов является негомологичное соединение концов (NHEJ), после которого на месте разрыва образуется индель, а замены аллеля не происходит. Для того чтобы оценить перспективность этого метода в случае млекопитающих, был разработан новый генетический элемент — CopyCat, который отличается тем, что не несет ген Cas9 и, соответственно, не может работать самостоятельно. Мишенью стал ген тирозиназы (Tyr), поскольку мутация в нем в гомозиготе дает легко отличимый фенотип альбиноса. Для получения работающего генетического элемента мышей с аллелем TyrCopyCat скрещивали с мышами, несущими ген Cas9.

Серия экспериментов со скрещиванием разных линий показала, что TyrCopyCat не копируется на вторую хромосому в раннем эмбриогенезе, несмотря на то, что система CopyCat-Cas9 работает исправно и создает двухцепочечные разрывы в нужном аллеле. Возможным объяснением является либо отсутствие выравнивания гомологичных хромосом, либо преобладание NHEJ. Обе проблемы решаются в мейозе, когда NHEJ активно подавляется в пользу гомологичной репарации, а гомологичные хромосомы находятся рядом. Поэтому был проведен эксперимент по скрещиванию, в котором Cas9 начинал экспрессироваться только в клетках зародышевой линии по мере их развития (это было реализовано с помощью Cre—Lox сайт-специфичной рекомбинации).

Результаты сильно отличались при внедрении получившейся системы в женские и мужские зародышевые клетки. В последних по-прежнему не наблюдалось копирования аллеля (или же его частота была слишком низка, чтобы его детектировать: по непонятным причинам такие самцы обладали низкой фертильностью). Однако в женских копирование происходило (его частота варьировалась в самках с одинаковым генотипом, наблюдаемый максимум — 72,2%). Это различие можно объяснить тем, что сперматогонии претерпевают многочисленные митозы перед тем, как стать сперматоцитами, в отличие от оогониев, которые без митозов дифференцируются в ооциты. Возможно, CRISPR-Cas9-система в сперматогониях активируется слишком рано — во время митоза, а не мейоза, с чем и связаны уже упомянутые проблемы.

Таким образом, при использовании системы CRISPR-Cas9 в млекопитающих с целью получения гомозигот главной проблемой является точная синхронизация времени экспрессии Cas9 с временем, когда в клетке эффективно происходит гомологичная репарация.

Однако наблюдаемая эффективность уже во много раз превосходит вероятность случайного образования гомозиготного потомства. Если же удастся превращать гетерозиготу в гомозиготу сразу по нескольким генам, то подобная технология станет незаменимой для моделирования различных полигенных заболеваний на мышах.