Новая CRISPR-система для редактирования геномов ксенографтных опухолей

Наиболее точными моделями опухолей in vivo служат ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (КПП) и пересаженные мышам. Эти модели воспроизводят сложные генотипы и гетерогенность опухолевых клеток и, в отличие от клеточных культур, не подвержены давлению отбора. Применение КПП для исследований функций генов в опухолях было ограничено невозможностью таргетного редактирования генома ксенотрансплантатов. Ученые из США разработали метод редактирования КПП системой CRISPR-Cas9 с использованием строго регулируемой индуцибельной нуклеазы Cas9.

Для применения в КПП система должна иметь, во-первых, оптимальный маркер на клеточной поверхности для селекции методом проточной цитофлуориметрии, во-вторых, оптимизированный титр лентивирусного вектора и в-третьих, жесткий временной контроль экспрессии Cas9.

Авторы статьи разработали pSpCTRE (Streptococcus pyogenes Cas9 Tet Response Element) — индуцируемый доксициклином лентивирусный вектор, кодирующий Cas9. Вектор также несет последовательность CD4^T — укороченного варианта мембранного рецептора CD4. CD4^T используется как поверхностный маркер для автоматической селекции тех клеток, в которых произошло внесение вектора. CD4^T был выбран в качестве маркера для работы с КПП, выращенными у иммунокомпрометированных мышей. Относительно недавно были разработаны методы трансплантации опухолей мышам с гуманизированной иммунной системой для изучения эффектов иммунотерапии. В такой модели маркер CD4^T использовать нельзя, но авторы утверждают, что вектор может быть адаптирован с помощью замены маркера на более подходящий.

Ученые проверили эффективность системы на разных моделях. Так, они трансдуцировали КПП in vivo вектором, несущим гидовую РНК к гену RPA1, или контрольным вектором с нетаргетной гидовой РНК. Мыши-реципиенты получали доксициклин с кормом. Вставки или делеции обнаруживались только в RPA1 опухолевых клеток, трансдуцированных вектором со специфичной гидовой РНК и экспрессирующих CD4^T в присутствии доксициклина.

Также ученые ex vivo (до прививки мышам), с помощью дополнительного вектора с матрицей для вставки по механизму гомологичной рекомбинации, вносили в КПП мутации, обеспечивающие резистентность опухоли к лечению. Через две недели резистентность развилась у опухолей, обработанных векторами, но контрольные необработанные опухоли остались чувствительными к препаратам.

Таким образом, новая система редактирования генома ксенотрансплантатов полезна для исследований в области функциональной геномики. Она может быть использована как для таргетного отключения генов, так и для анализа механизмов приобретенной лекарственной устойчивости.