Новые гены вирулентности возбудителя дизентерии выявили с помощью органоидов эпителия кишечника

Шигелла Флекснера (Shigella flexneri) — патоген, вызывающий дизентерию у человека и адаптированный исключительно к приматам. Всемирная организация здравоохранения относит шигелл к высокоприоритетным патогенам из-за стремительного появления клонов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью и отсутствия эффективной вакцины, Изучение механизмов вирулентности шигеллы осложняется тем, что традиционные модели (клеточные линии или животные) плохо воспроизводят физиологию человеческого кишечника и не отражают особенности инфекции у человека. Остается неясным, какие гены Shigella необходимы для колонизации человеческого кишечного эпителия.

Группа ученых из Швеции, Канады и Германии создала для решения этой задачи органоиды кишечного эпителия, то есть трехмерные комплексы эпителиальных клеток, полученных из стволовых клеток. Органоиды кишечного эпителия широко используются для изучения кишечных инфекций in vitro. Среди них различают энтероиды, полученные из эпителия тонкого кишечника, и колоноиды — из эпителия ободочной кишки. Кроме того, органоиды отличаются ориентацией клеток — наружу может быть обращена их базальная сторона или апикальная (то есть покрытая ворсинками, in vivo обращенная в просвет кишки).

Исследователи получали энтероиды и колоноиды с контролируемой полярностью, то есть состоящие из клеток в той или другой ориентации. (Шигелла заражает клетки преимущественно с базальной, а не с апикальной стороны, и можно предположить, что тот и другой путь зависят от разных генов.) Гены, необходимые для колонизации органоидов, картировали с помощью метода TraDIS (Transposon Directed Insertion Sequencing — транспозон-направленное секвенирование сайтов встраивания). Метод основан на случайной интеграции мини-транспозонов Tn5 в бактериальный геном. С помощью ПЦР-амплификации и секвенирования можно определить, какой ген затронут вставкой. Этот подход позволяет быстро и с небольшими затратами получать обширные библиотеки мутантных бактерий для последующего скрининга. Оценка обилия геномной ДНК с той или иной мутацией позволяет судить о ее влиянии на приспособленность и вирулентность бактерии. Анализ TraDIS авторы дополнили секвенированием РНК и протеомным анализом, чтобы связать эффекты мутаций с экспрессией факторов вирулентности.

Органоида успешно инфицировались шигеллой Флекснера с флуоресцентным репортером. Авторы создали библиотеку, включающую 130 тысяч мутантов в бактериальной хромосоме и в важной для вирулентности плазмиде pINV. Известно, что активность генов шигеллы зависит от температуры культивирования, так, ее система секреции типа III (T3SS) полностью экспрессируется при 37 °С, но не при 30 °С, поэтому авторы выполняли эксперименты в двух температурных режимах.

На органоидах удобно проводить скрининг патогенов с различными мутациями. Но результаты таких исследований может искажать эффект «бутылочного горлышка» — случайная, не связанная с приспособленностью гибель мутантов из-за ограничения питания или барьеров той или иной природы, мешающих проникнуть в клетки. Чтобы преодолеть эту проблему, авторы исследования оптимизировали экспериментальные процедуры и разработали оригинальную байесовскую модель для оценки истинной приспособленности мутантов.

По оценкам авторов, размеры «бутылочного горлышка» в их эксперименте составляли около 2000 бактерий с 1000–2000 уникальными вставками в геноме. Они рассчитали, что около 40 экспериментов с подбиблиотеками, содержащими 2000–3000 вставок, обеспечат покрытие 80% генома. Всего было проведено 43 эксперимента, что позволило провести скрининг более 112 тысяч мутантных клонов и получить количественную оценку приспособленности с помощью TraDIS примерно для 85 тысяч уникальных мутантов шигеллы. Скринингом было охвачено 86% аннотированных генов.

В итоге авторы выявили 143 генов, важных для колонизации эпителия: 105 хромосомных и 38 плазмидных (включая компоненты T3SS). Среди них гены трансмембранных транспортеров (acrAB, tolC), регуляторов стресса (rpoS, iraM), ферментов метаболизма серы (yftE, cysI, cysQ, yeeE) и тРНК-модификаторов mnmE и mnmG. Авторы также определили гены, важные для колонизации с апикальной или с базальной стороны клетки.

Примечательно, что исследователям удалось идентифицировать минимальный набор секретируемых эффекторов, связанных с T3SS и необходимых для колонизации кишечного эпителия (продукты ipgB1, ipgD, icsB и virA). Минимальный инфекто́м шигеллы представляет большой интерес с точки зрения разработки лекарств и вакцин, отмечается в комментарии Nature.

Ферменты MnmE и MnmG модифицируют уридин в антикодонах тРНК, влияя на трансляцию белков, обогащенных кодонами AGA и GGA. При делеции mnmE или mnmG резко снижалась и эффективность колонизации. Протеомный анализ и РНК секвенирование показали, что продукция T3SS-эффекторов снизилась, хотя их мРНК присутствовали, то есть снижение происходило на уровне трансляции.

Таким образом, впервые определен обширный набор генов Shigella, необходимых для колонизации физиологически реалистичной эпителиальной модели. Полученные данные демонстрируют, как геномные и трансляционные механизмы взаимодействуют для тонкой настройки вирулентности. Предложенный авторами подход может быть применен и к другим патогенам.

Все больше бактерий рода Shigella становятся устойчивыми к антибиотикам