Новый аденоассоциированный вирус проникает в мышцы, минуя печень

Для доставки трансгенов при генной терапии заболеваний мышц в качестве векторов используют аденоассоциированные вирусы (ААВ). Так как мышцы составляют более 40% массы тела, для эффективной терапии требуются достаточно высокие дозы (больше 10¹⁴ вирусных геномов/кг). Однако вирусные частицы могут накапливаться в печени, вызывая гепатотоксичность. Исследователи из французской компании Genethon разработали новый капсид ААВ, который нацеливает вектор на скелетные мышцы, но при этом минует печень; вектор с таким капсидом назвали LICA1.

Исследователи заметили, что у существующих вариантов ААВ, нацеленных на мышцы, есть один и тот же мотив из трех аминокислот — аргинина, глицина и аспартата. Этот мотив используется вирусами для связывания с интегринами — трансмембранными белками, которые участвуют в передаче межклеточных сигналов. Ученые показали, что в скелетных мышцах человека повышена экспрессия интегринового комплекса αVβ6, и поэтому занялись рациональным дизайном капсида, обладающего высокой аффинностью к этому комплексу.

Новый капсид оказался гибридом капсидов двух серотипов ААВ — AAV9 и AAV.rh74. Авторы также повысили эффективность наработки вирусных частиц. Полученные ААВ могли эффективно трансдуцировать как клетки HEK293, так и дифференцированные миотрубочки, но не их предшественники — миобласты, так как в них еще не экспрессируется αVβ6.

Исследователи показали, что через три недели после внутривенного введения таких вирусов мышам (10¹³ вирусных геномов на кг) они действительно не накапливаются в печени, в отличие от AAV9, но при этом снижалась и эффективность трансдукции скелетных мышц. Лучше всего мышечные клетки заражал вариант AAV9rh74_4um9, который ученые назвали LICA1 (linked-integrin complex AAV).

Авторы сравнили эффективность трансдукции скелетных мышц разными серотипами ААВ, которые обладают тропизмом именно к ним. Они сравнивали LICA1, AAVMYO, MYOAAV-1A и MYOAAV-2А. В in vitro тестах этими вирусами заражали клетки HEK293, которые оверэкспрессировали комплекс αVβ6. Наибольшим тропизмом обладал LICA1, который мог заражать, хотя и с меньшей эффективностью из-за низкого уровня экспрессии αVβ6, клетки HEK293 дикого типа и еще один их вариант, где вместо αVβ6 оверэкспрессировался α7β1. Это показало, что LICA1 может также использовать и другие интегрины для проникновения в клетку.

Ту же панель вирусов вводили мышам в дозировке 10¹³ вирусных геномов на кг. Все вирусы не накапливались в печени, практически не заражали почки, легкие и мозг и эффективно проникали в скелетные мышцы и мышцы сердца. При этом соотношение уровня трансдукции в скелетных мышцах к тому же уровню в печени было наибольшим у LICA1. Наилучшим тропизмом к сердечным мышцам обладал серотип MYOAAV-2A.

Исследователи подтвердили, что LICA1 может заражать клетки разных видов. Так, он может связываться с белковыми комплексами αVβ6 человека, мышей и крыс. Эксперименты также показали, что LICA1 может заражать и обезьян, например, макак-крабоедов, при этом он лучше трансдуцирует их мышцы и практически не накапливается в печени, в отличие от AAV8 и AAV9.

Далее ученые показали потенциал применения LICA1 для генной терапии мышечных заболеваний. Благодаря более высокому тропизму к скелетным мышцам его дозу можно снизить, таким образом снизив и риск возникновения токсичности. Ученые проверили эффективность доставки трансгена в мышиную модель миодистрофии Дюшенна — наследственного заболевания, вызванного мутациями в гене дистрофина. Так как он считается одним из крупнейших в организме человека, при генной терапии в качестве трансгена используют микродистрофин — неполную форму дистрофина, которая, тем не менее, сохраняет все его самые важные домены. Мышам линии mdx в течение четырех недель вводили LICA1 либо AAV9 с микродистрофином в малых дозах — 5 ⋅ 10¹² вирусных геномов на кг. LICA1 доставлял трансген гораздо эффективнее по сравнению с AAV9: LICA1 заражал 100% клеток передней большеберцовой мышцы и квадрицепса и 50% клеток диафрагмы, в то время как AAV9 — 73,22%, 57,8% и 10,34% клеток соответственно. При этом LICA1 не накапливался в печени.

После генной терапии у мышей снизилась дегенерация мышц и фиброз, упал уровень белка MYOM3 в сыворотке — маркера повреждения мышц. Эксперименты, в которых проверялась мышечная сила мышей, показали, что при генной терапии с использованием AAV9 не удается восстановить функцию мышц, в отличие от терапии с использованием LICA1.

Эффективность LICA1 также показали при доставке полноразмерного гена α-саркогликана в мышиную модель конечностно-поясной мышечной дистрофии R3 — еще одной мышечной дистрофии, которая вызвана мутациями в гене α-саркогликана. AAV9 и LICA1 вводили в том же режиме, что и в прошлом эксперименте, и наблюдали, что LICA1 может трансдуцировать почти 100% мышечных волокон, тогда как AAV9 — только 58% в среднем. Тем не менее, эффективность заражения диафрагмы — наиболее пораженной мышцы в этом заболевании — была снижена в обоих случаях. Вместе с тем при использовании LICA1 удавалось снизить уровень фиброза и дегенерации мышц. Однако в тестах на мышечную силу мыши из обеих групп показывали себя одинаково хорошо.

Эффективность генной терапии варьировала при разных заболеваниях на молекулярном уровне. Хотя эффективность трансдукции была сравнимой в обоих случаях, на транскрипционном уровне, как показал анализ транскриптома передней большеберцовой мышцы, изменения были значительнее в случае конечностно-поясной мышечной дистрофии R3. Такие различия ученые объясняют тем, что при генной терапии миодистрофии Дюшенна используется неполная форма дистрофина, с чем и может быть связана недостаточная эффективность терапии. Тем не менее, LICA1 показал себя как многообещающий вектор с тропизмом к скелетным мышцам, который позволяет значительно снизить дозу вируса.

Мышам с миодистрофией Дюшенна доставили полноразмерный дистрофин с помощью белкового транс-сплайсинга