Новый метод изучения трансляции протестировали на синтетическом транскриптоме E. coli

Ученые из Вюрцбургского университета (Германия) разработали новый протокол анализа трансляции, основанный на бесклеточной системе.

К настоящему времени наиболее популярным методом для прямого изучения синтеза белка стало рибосомное профилирование, или Ribo-seq. Суть его в следующем: участки РНК, не занятые рибосомами, разрушают с помощью рибонуклеаз, затем секвенируют участки, защищенные от разрушения рибосомами, и таким образом определяют их положение. Метод позволяет оценивать интенсивность трансляции тех или иных мРНК или искать сайты инициации трансляции (TIS). Однако есть факторы, ограничивающие применение Ribo-seq для анализа молекул, изменяющих активность трансляции. Так как этот метод применяется к живым клеткам, на результаты может влиять клеточный ответ, при этом отличить прямое воздействие молекулы на трансляцию от непрямого довольно сложно.

Чтобы преодолеть эти ограничения, авторы новой работы адаптировали Ribo-seq к условиям in vitro. Метод получил название INRI-seq (от in vitro Ribo-seq). В нем объединены коммерческое решение PURExpress (New England Biolabs) для трансляции in vitro и синтетический транскриптом.

INRI-seq проверили на синтетическом транскриптоме Escherichia coli. Чтобы его получить, ученые создали пул из 4 386 уникальных одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов, покрывающих все аннотированные кодирующие последовательности (CDS) E. coli. Каждая CDS содержала природный старт-кодон, первую открытую рамку считывания, сайт связывания рибосомы, сильный стоп-кодон, последовательность, терминирующую трансляцию, а также промотор T7 РНК-полимеразы, облегчающий транскрипцию in vitro. Пул ДНК-олигонуклеотидов сначала превращался в набор двухцепочечных ДНК с помощью ПЦР, затем транскрибировался.

К полученному таким образом синтетическому транскриптому применялся набор PURExpress и антибиотик ретапамулин, который блокирует рибосому на старт-кодоне. В условиях конкретного эксперимента рибосомы превращались в 70S монорибосомы. Чтобы выделить их вместе с защищенными ими фрагментами РНК, реакционную смесь обрабатывали микрококковой нуклеазой — агрессивным ферментом, который разрушает нуклеиновые кислоты, не связанные с белком. После этого РНК очищали и использовали для секвенирования. Рибосома защищает 14–16 нуклеотидов мРНК, лежащих ниже первого нуклеотида старт-кодона. На TIS указывал 3’-конец этой последовательности.

С помощью INRI-seq ученые подтвердили аннотированные TIS для 3 059 из 4 386 генов E. coli (около 70%). При использовании того же метода обработки данных метод Ribo-seq с ретапамулином, примененный к живым клеткам, обнаружил только 18% TIS, что говорит о большей чувствительности INRI-seq. Кроме того, метод подтвердил 51 из 64 альтернативных TIS, идентифицированных in vivo, и выявил 918 предположительных новых TIS.

Наконец, ученые использовали INRI-seq для анализа действия ингибиторов трансляции — пептидо-нуклеиновых кислот (PNA). Это антисмысловые олигомерные молекулы, которые потенциально могут использоваться для таргетного уничтожения патогенных бактерий, не затрагивающего нормальную микрофлору. Результаты, полученные для хорошо описанной PNA, совпадали с данными предыдущих исследований. С помощью INRI-seq авторы работы подтвердили снижение трансляции мишени PNA и описали нецелевые гены, для которых также наблюдалась даунрегуляция.

Таким образом, метод INRI-seq позволяет идентифицировать TIS и описывать работу ингибиторов трансляции. К ограничениям исследования авторы относят несовершенство PURExpress. Набор хорошо подходит для работы с E. coli, но к транскриптомам других бактерий нужно применять альтернативные системы трансляции in vitro. Тем не менее, ученые утверждают, что INRI-seq — перспективный метод для изучения различных аспектов трансляции.