Рибосомное профилирование выявило альтернативные старт-кодоны у бактерий

Каким образом живое существо в ходе эволюции может увеличить разнообразие своих белков, желательно не слишком увеличивая размер генома? Эта проблема имеет несколько решений. Одно из них — использование разных старт-кодонов в одной открытой рамке считывания (ORF). Подобные примеры известны у бактерий. Однако обнаружение таких дополнительных сайтов инициации трансляции (iTIS) — все еще не решенная задача, поэтому большинство функциональных iTIS, вероятно, остаются незамеченными.

Группа под руководством ученых из Иллинойсского университета в Чикаго обнаружила, что антибиотик ретапамулин, блокирующий элонгацию трансляции, не дает рибосоме покинуть старт-кодон. Это свойство выгодно отличает его от другого блокирующего трансляцию антибиотика — тетрациклина, который ранее применялся для выявления старт-кодонов методом рибосомного профилирования (он же рибосомный футпринтинг: участки РНК, не занятые рибосомами, разрушают с помощью рибонуклеаз, затем секвенируют участки, защищенные от разрушения рибосомами, и таким образом определяют их положение. Метод позволяет определять интенсивность трансляции тех или иных мРНК или, как в данном случае, искать сайты инициации.) Распределение рибосом по мРНК после обработки ретапамулином дает более четкие и высокие пики в местах старт-кодонов, чем после обработки тетрациклином. Свой метод авторы назвали retapamulin-enhanced Ribo-seq analysis (Ribo-RET).

Однако помимо пиков в известных сайтах инициации трансляции (TIS) пики наблюдались и в других местах, причем как внутри, так и вне известных ORF. Эти пики включали немногочисленные уже известные iTIS, и более половины их совпадало у двух разных штаммов E.coli. Найденные iTIS имели старт-кодоны, для которых ранее была показана их инициаторная роль, а многие содержали и последовательность Шайна — Дальгарно (сайт связывания рибосомы).

Например, в гене arcB, кодирующем кислород-чувствительную киназу ArcB, был обнаружен iTIS точно на 5′-границе фрагмента, кодирующего ArcB-C-домен белка. Трансляция 3′-FLAG-фьюжн-ArcB подтвердила синтез и цельного белка, и отдельно ArcB-C-домена. Такой диффузный ArcB-C-домен дает преимущество клеткам в микроаэробных условиях: возможно, он облегчает передачу сигнала ArcB-ArcA или же подключает прочие сигнальные системы.

Другим «применением» iTIS может быть наличие или отсутствие сигнального пептида в составе белка и, соответственно, различная локализация белка с пептидом и без.

Также авторы обнаружили OOF iTIS — iTIS со своим стоп-кодоном (т. е. образующие свою ORF), лежащие в альтернативной рамке считывания. Ранее были описаны только две такие рамки. На примере двух OOF iTIS ученые убедились в способности найденных сайтов инициировать трансляцию.

В некоторых OOF iTIS стоп-кодон шел сразу за старт-кодоном. Такие старт-стоп-сайты были ранее описаны в 5′-UTR некоторых вирусных и растительных генов, где они играют регуляторную роль. Ученые показали, что наличие старт-стоп-сайта в гене yecJ ослабляет трансляцию основной ORF, что свидетельствует о возможной регуляторной функции. Более того, сила эффекта, возможно, зависит от положения cтоп-кодона в ORF.

В большинстве случаев функция трансляции с iTIS неизвестна, однако можно предположить несколько сценариев. Продуктом трансляция с iTIS внутри ORF может быть изоформа белка с другой функцией; возможно, такая изоформа будет образовывать с основным белком рамки гетеродимер, свойство которого будут иными, чем у гомодимера. Трансляция с iTIS, близкого к 5′-концу, может приводить к изменению локализации белка и его стабильности (поскольку то и другое сильно зависит от N-концевой аминокислоты). Наконец, при использовании OOF iTIS образуются полипептиды, чья структура и функции никак не связаны с основным белком.

Предложенный авторами метод картирования сайтов инициации трансляции у бактерий позволил обнаружить до сих пор не известную часть бактериального протеома и понять некоторые механизмы регуляции генов. Полученные знания также можно применить в борьбе с вредоносными бактериями.