Новый подход к нанопоровому секвенированию белков

Существующие подходы к нанопоровому секвенированию белков пептидная цепь проходит через нанопору под воздействием внешнего электрического поля либо с помощью молекулярных моторов. Аминокислотная последовательность определяется с помощью измерения ионного тока, масс-спектрометрии и других методов. Реализация однонаправленного транспорта через нанопору и распознавание аминокислот по электрическому сигналу до сих пор остаются наиболее сложными задачами в этой области.

Группа ученых из США, Франции и Германии предложила технику детекции протеиногенных аминокислот по изменению ионного тока в аэролизиновой нанопоре. Эта техника в перспективе может быть применена для секвенирования белков.

Аэролизин — это бактериальный порообразующий токсин. Ранее было показано, что он может использоваться в качестве наносенсора для секвенирования ДНК. Для экспериментальной работы ученые встроили нанопору из аэролизина дикого типа в липидный бислой и поместили конструкцию в измерительную ячейку с раствором электролита. Липидная мембрана разделяла ячейку на две части: цис и транс. Соответственно, у самой мембраны образовались цис- и транс-стороны. К транс-стороне липидного бислоя прикладывали внешнее отрицательное электрическое напряжение. Цис-сторона была заземлена. Если в ячейке не было других соединений, ионный ток через пору имел постоянное значение.

С цис-стороны мембраны в ячейку помещали аминокислоты, связанные с поликатионным носителем. В качестве носителя выбрали гептапептид, состоящий из остатков аргинина. Известно, что при попадании в аэролизиновую нанопору этот гептапептид блокирует ионный ток. Аминокислоты, связанные с носителем, представляли собой пептиды. Ученые синтезировали пептид вида «аминокислота + носитель» для каждой из 20 протеиногенных аминокислот, получив в итоге 20 разных пептидов. Пептиды из ячейки попадали в нанопору. При захвате порой одной пептидной молекулы ионный ток блокировался. Для каждого такого события авторы регистрировали остаточный ионный ток и время блокировки. Оказалось, что для разных аминокислот эти характеристики различаются.

Чтобы понять механизмы прерывания ионного тока в нанопоре, авторы построили компьютерную модель системы на основе данных криоэлектронной микроскопии. Оказалось, что в средней части поры образуется область с постоянным электрическим потенциалом. Заряженные молекулы при попадании в эту область задерживаются на некоторое время. При этом разница сигналов для разных аминокислот обусловлена отличиями не в молекулярной массе, а в их динамических объемах.

Система с нанопорой из аэролизина дикого типа с большой точностью распознала 13 из 20 природных аминокислот: аргинин, триптофан, фенилаланин, лизин, лейцин, аспарагин, треонин, пролин, аспарагиновую кислоту, аланин, цистеин, серин и глицин. Остальные 7 распределились на две группы. В первую попали глутамин, метионин, гистидин, изолейцин и тирозин. Во второй оказались глутаминовая кислота и валин. Различия между аминокислотами внутри этих групп были недостаточно четкими. Тогда ученые химически модифицировали аэролизиновую нанопору с транс-стороны, чтобы повысить чувствительность системы. С помощью нового варианта поры можно было детектировать 13 аминокислот, указанных выше, а также метионин и тирозин.

Эксперименты с эквимолярными смесями пептидов показали, что система отличает аминокислоты, близкие по молярной массе и объему. Кроме того, можно было различить химические модификации аминокислот, то есть этот подход может быть применен для секвенирования белков с учетом посттрансляционных модификаций аминокислотных остатков.

Авторы предлагают концепцию параллельного секвенирования белков на основе нового метода. На первом этапе процесса в белке будет вырезаться терминальная аминокислота. Затем эта аминокислота должны быть залигирована на пептидный носитель. Последний шаг — проход конструкции через нанопору. Множество таких процессов может быть проведено параллельно в изолированных объемах с синхронизированной циркуляцией реагентов. Последовательное вырезание аминокислотных остатков может быть осуществлено с помощью протеазы ClpXP, для которой уже показана возможность работы вместе с нанопорой. В этом случае фермент можно связать с нанопорой и первым шагом проводить лигирование, чтобы избежать засорения нанопоры вырезанными аминокислотами.