Новый РНК-аптамер подавляет связывание S-белка коронавируса с АСЕ2

Исследователи из Орхусского университета (Дания) и Регенсбургского университета (Германия) получили небольшие РНК-молекулы — аптамеры, способные специфически взаимодействовать с рецепторсвязывающим доменом (RBD) S-белка SARS-CoV-2 и мешать вирусу проникнуть в клетку.

Аптамеры — это небольшие одноцепочечные молекулы РНК или ДНК, способные связываться с другими биомолекулами. Их можно использовать для различных задач: для детекции молекул и диагностики, в исследовательских целях, для аффинной очистки молекул-мишеней, для специфичного ингибирования белков-мишеней, для направленного транспорта лекарств. Некоторые ученые рассматривают аптамеры как альтернативу моноклональным антителам, поскольку они значительно проще в получении.

В том числе ученые рассматривают возможность использовать аптамеры для терапии COVID-19. Первая работа, в которой описали аптамеры, связывающие RBD S-белка нового коронавируса, вышла еще в июне 2020 года.

В новой работе авторы поставили своей целью получить стабильные аптамеры и оптимизировать их под максимально возможную авидность связывания с RBD.

Отбор аптамеров осуществлялся методом SELEX с помощью рекомбинантного RBD S-белка SARS-CoV-2 дикого типа. Использовали библиотеку из молекул РНК длиной в 36 нуклеотидов с рандомизированными последовательностями. На восьмом цикле был отобран аптамер RBD-PB6, продемонстрировавший сильное связывание с RBD и тримерным S-белком.

Для оценки связывания отобранного аптамера с RBD использовали оптические методы — биослойную интерферометрию (BLI) и FIDA, позволяющие в реальном времени анализировать взаимодействие биомолекул без использования метки и получать количественные характеристики взаимодействия. Анализ показал, что RBD-PB6 связывает RBD с высокой степенью аффинности.

Также исследователи проанализировали связывание с RBD другого аптамера — CoV2-RBD-1C, ранее предложенного учеными из Китая. Оказалось, что взаимодействие этого аптамера с RBD носит неспецифический характер и, по-видимому, связано с гистидиновым тегом в составе рекомбинантного белка. BLI-анализ конкурентного ингибирования связывания RBD с иммобилизованным АСЕ2 показал, что аптамер RBD-PB6 подавляет это взаимодействие.

Основываясь на предсказанной структуре аптамера, авторы создали ряд его укороченных вариантов, которые также проверили в конкурентном анализе. Оказалось, что структуру можно укоротить с 80 до 53 нуклеотидов (RBD-PB6-Ta) без потери аффинности.

Способность аптамера нейтрализовать коронавирус исследовали на вирусоподобных частицах (VLP), сконструированных на основе инактивированного ВИЧ c S-белком SARS-CoV-2 в составе оболочки. В эти частицы поместили вектор EGPF, кодирующий зеленый флуоресцентный белок. VLP заражали клетки HEK293T, трансфицированные плазмидами, экспрессирующими АСЕ2 и TMPRSS2. Одновременно с заражением VLP к клеткам добавляли аптамеры — «длинный» RBD-PB6, укороченный RBD-PB6-Ta и контрольный, не связывающийся с RBD. RBD-PB6В и RBD-PB6-Ta хорошо нейтрализовали VLP. При этом оба аптамера не нейтрализовали VLP с S-белками других бетакоронавирусов — SARS-CoV-1 и MERS.

Авторы предположили, что мультимеризация может увеличить авидность связывания с аптамерами, поскольку сам S-белок является тримером. Для проверки этого предположения создали димеры и тримеры, связав между собой молекулы RBD-PB6-Ta с помощью олигоаденозиновых ДНК-линкеров. Оказалось, что димеры и тримеры значительно эффективнее связываются с тримерным S-белком.

Также авторы показали, что модифицированные 2’-фторпиримидинами аптамеры гораздо стабильнее в среде, чем немодифицированные.

«Длинный» и укороченный аптамеры связываются с RBD штаммов альфа и бета с высокой эффективностью, сопоставимой с таковой для белка дикого типа.

«С тех пор, как мы отправили статью на рецензирование, мы продолжили наши исследования и смогли показать, что он [аптамер] распознает и вариант дельта. Теперь мы ждем образцов недавно идентифицированного варианта омикрон, чтобы проверить, распознает ли его аптамер», — говорит Йорген Кемс, профессор Орхусского университета и последний автор статьи.