Обратимая деградация белков теперь возможна в мышах

Японские ученые из Национального института генетики в Мисиме с коллабораторами усовершенствовали свою систему обратимой ауксин-индуцированной деградации белков (AID) для изучения их функций в клетках дрожжей и животных.

В основе системы лежит способность фитогормона ауксина (indole-3-acetic acid; IAA) запускать деградацию белка, модулируя активность убиквитин-лигазного комплекса SCF. Рецепторы этого гормона (transport inhibitor response1, TIR1) присутствуют только в растениях, но их можно экспрессировать в клетках других видов. При обработке таких клеток ауксином происходит активация рецептора и формирование комплекса TIR1 с эндогенным SCF, необходимого для деградации белков. Разрушаться будут только те белки, к которым подшит специальный домен — дегрон. Несмотря на успешное применение AID во многих случаях, у системы наблюдались такие недостатки, как преждевременная (до воздействия ауксина) деградация белка и относительно высокая доза гормона, необходимая для активации.

Опираясь на разработки другой японской группы, команда создала более совершенную систему AID2. Ученые протестировали активность вариантов рецептора TIR1 риса (OzTIR1) с мутациями, создающими искусственный зазор в сайте связывания с ауксином, но с высокой специфичностью к синтетическим лигандам на его основе. Выяснили, что в культуре человеческих клеток комбинация рецептора с мутацией F79G и аналога ауксина с фенильной модификацией в пятой позиции индольного кольца (5-Ph-IAA) позволяет полностью избежать преждевременной деградации и требует в 670 раз меньше фитогормона для активации по сравнению с оригинальной системой, использующей природные варианты TIR1 и IAA.

Синтетическая комбинация не только исправляет недостатки в уже работающих системах, но и эффективна в случаях, которые до настоящего времени не поддавались изучению с помощью контролируемой деградации. В числе последних инициация репликации в дрожжах и формирование веретена деления в человеческих клетках. В отличие от натурального ауксина, синтетический гормон можно без вреда вводить мышам и запускать контролируемую деградацию в опухолевых трансплантатах, экспрессирующих белки с дегроновой последовательностью. Кроме того, ученые создали линию трансгенных мышей с модифицированным TIR1 и продемонстрировали успешную деградацию репортерного белка во всех протестированных тканях.

Надежность полученных результатов подтверждается аналогичными наблюдениями в клеточных линиях с использованием синтетической пары OzTIR1^F74A – 5-Ad-IAA, опубликованными двумя месяцами ранее учеными из Нагойского и Осакского университетов (Япония).