Органоиды восстановили функцию поврежденной печени у мышей

Распространенность заболеваний печени, в том числе метаболической дисфункции, продолжает расти, тогда как их профилактика и разработка методов лечения ограничены. Отчасти это связано с нехваткой моделей, которые точно воспроизводили бы метаболические функции гепатоцитов человека. Перспективной моделью считаются органоиды — трехмерные клеточные структуры, которые призваны имитировать человеческие органы. Их также можно было бы применять в регенеративной медицине. Однако выращивание органоидов печени сопряжено с рядом трудностей. Одна из них — это поддержание клеточной идентичности гепатоцитов одновременно с их пролиферацией. Пролиферирующие гепатоциты часто подвергаются протоковой метаплазии — они перепрограммируются в клетки протокового эпителия, чтобы сбалансировать энергозатраты на выполнение основных функций клеток и на репликацию. Исследователи из Токио нашли способ вмешаться в этот баланс и создали органоиды печени из криоконсервированных гепатоцитов взрослого человека.

Предыдущие исследования выявили общие драйверные гены у раковых клеток и у стволовых клеток ткани в ткани происхождения, и ученые предположили, что факторы стволовости для клеток органоида можно предсказать на основе геномики рака. Они проанализировали данные Атласа ракового генома (TCGA) по гепатоцеллюлярной карциноме и обнаружили изменения в путях WNT, RAS, TGFβ, STAT3 и протеинкиназы А (PKA). Чтобы имитировать активацию или ингибирование драйверных генов, исследователи создали среду для выращивания органоидов, в которую добавили связанные с выявленными путями факторы роста. В число компонентов вошли эпидермальный и гепатоцитарный факторы роста, фактор роста фибробластов FGF-10, Wnt/R-спондин, ингибиторы факторов семейства TGFβ (A83-01 и Noggin), интерлейкин 6 (IL-6) и форсколин (активатор PKA). В такой среде из гепатоцитов формировались небольшие кистозные органоиды с толстой монослойной выстилкой, экспрессирующей маркеры гепатоцитов — альбумин и HNF4α.

Полученные органоиды росли в течение 2–3 месяцев; скорость пролиферации в них замедлялась уже через месяц после формирования, но стимулировалась IL-6. Когда ученые проверили, какой эффект окажут другие STAT3-активирующие цитокины, они обнаружили, что наиболее выраженно пролиферацию усиливал онкостатин М. В присутствии этого цитокина органоиды продолжали расти в течение трех месяцев и прожили полгода, не потеряв способности к дифференцировке.

Уже установлено, что активация YAP служит ключевым фактором пролиферации гепатоцитов, однако она направляет их по пути превращения в протоковые клетки. Однако в присутствии онкостатина M она усиливала пролиферацию, не приводя к протоковой метаплазии. Транскриптомный анализ показал, что активация STAT3 онкостатином М блокировала индукцию факторов транскрипции билиарной линии и активацию TGFβ, поэтому пролиферация, активированная сигналом YAP, сохраняла клеточную идентичность гепатоцитов.

Для оценки регенеративного потенциала органоидов авторы подсаживали их иммунодефицитным мышам, гепатоциты которых были повреждены ганцикловиром. Приживление ксенотрансплантата подтвердили по появлению человеческого альбумина в сыворотке крови и окрашиванию тканей печени на человеческий антиген STEM121.

Что интересно, прижившиеся органоиды воспроизводили метаболическую зональность — уникальную гистологическую архитектуру печени. Это побудило авторов оптимизировать условия для функционального созревания органоидов в культуре. После ряда экспериментов они удалили из среды факторы стволовой ниши (онкостатин М, Wnt/R-спондин и Noggin) и внесли в нее коктейль гормонов (гормон роста, пролактин и кортизол) вместе с ингибитором γ-секретазы (DAPT). Когда к органоидам, культивированным в таких условиях, добавляли Wnt/R-спондин, они начинали экспрессировать маркеры центральной вены. Дефицит глюкозы вызывал экспрессию маркеров воротной вены.

Дифференцированные органоиды оказались способны к синтезу желчных кислот — гены CYP7A1 и AKR1D1, лимитирующие некоторые стадии этого процесса, экспрессировались на повышенном уровне. Анализ методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) подтвердил выработку желчных кислот, а иммуноокрашивание и электронная микроскопия выявили наличие сети желчных каналов. Также клетки органоидов накапливали в себе липиды, то есть обладали основными метаболическими функциями печени, сопоставимыми с таковыми у гепатоцитов in vivo.

Кроме того, органоиды оказались более релевантной моделью гепатотоксичности лекарств, чем созданные ранее модели гепатоцитов. Токсичность, вызванная ацетаминофеном, индуцировала повреждения в клинически актуальной дозе, но эффект блокировался N-ацетилцистеином — одобренным в клинике антидотом против отравления ацетаминофеном.

Также исследователи подтвердили возможность редактирования генома в органоидах, хотя для этого им пришлось несколько модифицировать протоколы доставки систем редактирования.

Авторы заключают: разработанная технология представляет собой стабильную, воспроизводимую и экономически эффективную платформу для изучения метаболизма печени человека. Кроме того, она может найти применение в регенеративной медицине, открывая новые горизонты в решении проблемы печеночной недостаточности.

Миниатюрная печень в глазу сообщает о состоянии большой печени