London Calling 2026: секвенирование онкогеномов, крови и воздуха

Доклад Томаса Александера, специалиста по педиатрической онкологии из Университета Северной Каролины, назывался «От инновации к глобальному влиянию: адаптивное секвенирование генома для детской лейкемии».

Докладчик рассказал о клиническом случае, с котором ему пришлось столкнуться два года назад. Ребенок страдал от боли, у него были новообразования в костях и брюшной полости; биопсия давала неоднозначные результаты — специалисты по солидным опухолям были уверены, что это лейкемия, гематопатологи — что это солидная опухоль. Результаты секвенирования можно было получить только через несколько недель, а тем временем ребенку назначили химиотерапию, хотя не было уверенности, что она поможет.

Сегодня существуют различные подходы к диагностике онкозаболеваний, помимо классических, принятых в клинике. На клеточном уровне это анализ морфологии клеток, иммуногистохимия и проточная цитометрия, на генетическом — методы «макрогенетики», позволяющие выявлять изменения в числе хромосом и крупные перестройки, и, наконец, молекулярные методы — анализ точечных мутаций, слитых генов/белков, изменения числа копий генов, метилирования ДНК, а также транскриптома (РНК). Однако в большей части стран мира есть проблемы с доступом к молекулярным методам из-за высокой стоимости, нехватки квалифицированных кадров и сложностей с поставками.

Докладчик с коллегами провели исследование, чтобы понять, может ли изменить эту ситуацию полногеномное нанопоровое секвенирование, использующее адаптивное сэмплирование (об этом подходе, который дает возможность читать только интересующие участки генома, рассказывали представители Oxford Nanopore Technology) Исследование должно было ответить на три вопроса: «это доступно по цене?», «это работает?» и «это реализуемо?»

Авторы подтвердили, что нанопоровое секвенирование способно идентифицировать широкое разнообразие онкогенных изменений в геноме. Предложенный подход они использовали, чтобы помочь пациенту, о котором рассказывалось в начале; на тот момент технология была еще не вполне зрелой, но у пациента и его близких не было возможности ждать, отметил докладчик. Они решили предпринять попытку на лабораторном семинаре в понедельник, во вторник провели секвенирование образцов, а в среду уже выявили слитый ген, связанный с миелоидным лейкозом — итого два дня вместо двух недель. Стало ясно, что на химиотерапию, которую собирались назначить, пациент бы не ответил.

Полногеномное cеквенирование может заменить значительную часть существующих тестов, от кариотипирования до транскриптомики и таргетных панелей, отметил докладчик. Оно выявляет анеуплоидии, слитые гены (фьюжены), варианты числа копий, однонуклеотидные варианты, тандемные повторы, мишени для фармакогеномики. Есть подходы и для паттернов экспрессии и определения типа клеток.

Дальнейшие исследования проводились в больницу Университета Северной Каролины (UNC Health), Центре детской онкологии принцессы Максимы (Утрехт, Нидерланды), Tata Medical Center в Калькутте (Индия) и Indus Hospital and Health Network в Карачи (Пакистан), таким образом, подход был валидирован в странах как с высоким, так и с низким уровнем дохода. Секвенирование на PromethION проводилось до достижения покрытия таргетов ≥20x. Точность обнаружения аномалий после анализа данных сравнивали с результатами стандартных клинических тестов.

Были проанализированы сотни образцов от пациентов с онкозаболеваниями крови, в том числе случаи В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL), острого миелоидного лейкоза (AML), Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL). В итоге из 331 случая B-ALL после добавления данных по метилированию не идентифицировали подтип только для 13 (4%), тогда как традиционные методы клинической диагностики не смогли классифицировать 101 случай. Из 83 случаев AML традиционные методы не классифицировали 21, а новый протокол, основанный на нанопоровом секвенировании, только 10. Также были обнаружены фармакогеномные аллели. Таким образом, ответ на вопрос, «работает ли это», положительный.

Что касается доступности по цене, стоимость расходных материалов в основном была в пределах $350–450 долларов США за мультиплексный образец (при анализе нескольких образцов в одной ячейке). Положительным был и ответ на реализации в клинической практике: «В этом году мы вполне могли бы провести еще несколько исследований в UNCC, опубликовать еще одну статью и, по сути, ничего принципиально не изменить, но сейчас мы фактически завершили все исследования в клинической лаборатории, и все четыре центра движутся к клиническому внедрению этого теста в качестве лабораторного диагностического подхода», — сказал докладчик. Если в 2025 году были проанализированы десятки образцов, а в 2026-м — сотни, есть надежда, что в 2027-м будут уже тысячи при участии десятков медицинских центров в разных странах.

Что касается ребенка, о котором говорилось в начале, он прошел эффективную и значительно менее токсичную терапию амбулаторно, а не в стационаре, достиг ремиссии и был готов к трансплантации.

Люк Благдон Снелл из Королевского колледжа Лондона рассказал о внедрении метагеномики в систему здравоохранения Великобритании.

Современные методы диагностики серьезных инфекций работают недостаточно хорошо. Используемые в настоящее время методы тестирования требуют разделения образца для проведения разных анализов. Есть мультиплексные ПЦР, но с их помощью можно детектировать только 10–20 таргетов одновременно. В то же время растет число пациентов с подавленным иммунитетом (это уже около 4% населения Европы). У них повышен риск необычных и редких инфекций. Также растет число микроорганизмов, резистентных к антимикробным препаратам. Повышается риск пандемий из-за урбанизации и изменения климата. Существует угроза биобезопасности и появления новых, синтетических и мутировавших патогенов. Современные методы диагностики не справляются с этими вызовами.

При анализе метагенома можно взять образец у пациента, напрямую секвенировать все нуклеиновые кислоты и таким образом выявить все патогены — бактерии, вирусы, грибы и паразиты. И не только выявить, но и охарактеризовать чувствительность к антимикробным препаратам и факторы вирулентности.

Использование нанопорового секвенирования для клинической метагеномики позволяет получить результаты быстро и анализировать их в реальном времени, длинные прочтения облегчают классификацию микроорганизмов при сравнении с базой данных.

Адела Алколеа-Медина из Synnovis (Великобритания) подробнее рассказала, как это работает. В респираторном образце определяются бактерии, грибки, РНК- и ДНК-вирусы. Основная проблема — присутствие ДНК организма-хозяина, так что сначала образец центрифугируют, обогащая супернатант микроорганизмами. Затем извлекают нуклеиновые кислоты из оставшихся клеток. Расщепляют внеклеточные ДНК и РНК организма-хозяина, получают нуклеиновые кислоты микроорганизмов. На матрице РНК синтезируют двуцепочечные ДНК, готовят библиотеки для секвенирования. Предварительные данные можно получить уже через 6,5 часов.

При ретроспективном сравнении с рутинными методами — культивированием и мультиплексными ПЦР — чувствительность нанопорового секвенирования достигла 90% при определении бактерий и 92% при определении вирусов.

В проспективном валидационном исследовании тестировали 114 образцов 74 взрослых пациентов. Из них 94% прошли контроль качества. Чувствительность и специфичность были сходными с предыдущим исследованием. Метод также опробовали на 122 детях и получили аналогичные результаты.

При внедрении метода в отделения реанимации и неотложной помощи обращали особое внимание на контроль качества, стандартизацию процедур, пороги обнаружения. Подход валидировали, для него доступно руководство, объясняющее, в каком формате следует выдавать результаты клиницистам, подход интегрирован в LIMS (Laboratory Information Management Systems — платформа ПО, широко используемая национальными службами здравоохранения, частными клиниками и фармкомпаниями). Был выполнен внешний контроль качества, поданы документы на аккредитацию ISO и получена рекомендация для аккредитации в UKAS.

Доклад продолжил Люк Снелл и рассказал, что нанопоровое секвенирование позволяет выявить на 25–30% больше патогенов, чем стандартные методы. Метагеномика агностична — с ее помощью можно выявить патогены, о присутствии которых клиницисты даже не подозревают. Примерно в 25% случаев находки метогеномного исследования позволили изменить лечение, причем в двух из трех случаев можно было назначать меньше антибиотиков.

Внедрение метагеномики позволило выявить редкие случаи, например, краснуху, источником которой была вакцина, диагностировать ВИЧ из респираторного образца, обнаружить циркуляцию вируса гриппа C и различных зоонозных заболеваний.

Рис Уайт (Институт экологических наук и исследований, Новая Зеландия) рассказал о мониторинге резистентных микроорганизмов в медучреждениях с помощью нанопорового секвенирования. С докладом на ту же тему он выступал и на London Calling 2025, а в этом году представил продолжение.

Лекарственно-устойчивые патогены создают существенные риски для пациентов, а классические методы их детекции занимают много времени. Секвенирование в специализированных центрах позволяет получить ответ лишь через несколько дней или даже недель — проблема, хорошо известная во всех странах мира. Альтернативой может быть секвенирование на месте с помощью такого прибора, как MinION.

В 2022 году докладчик с коллегами начали применять нанопор для «проспективного мониторинга» (регулярное секвенирование больничных изолятов) и «быстрого реактивного секвенирования» неожиданно появившихся устойчивых патогенов. Проспективное секвенирование (точнее, нанопоровое мультилокусное сиквенс-типирование (MLST)) позволило оперативно отследить и локализовать вспышку Clostridioides difficile ST2 в отделении трансплантации костного мозга, Klebsiella variicola ST 6385 в отделении интенсивной терапии новорожденных и т.п.

 Филогенетическое дерево Clostridioides difficile, выявленных в региональной больнице Веллингтона (Новая Зеландия), построенное методом максимального правдоподобия на основе 37 441 однонуклеотидного варианта в 61 геноме. Синим цветом обозначены интересующие случаи ST2 в отделении, где проводилась трансплантация.

Мультилокусное сиквенс-типирование — эффективный метод, но его возможности ограничены при появлении редкого микроорганизма, подчеркнул докладчик. Полногеномное нанопоровое секвенирование с использованием облачной автоматизированной биоинформатической платформы Solu Genomics меняет правило игры.

Децентрализованная модель мониторинга, основанного на секвенировании, облегчает выявление связей между вспышками в разных больницах. Пациенты (вместе со своими бактериями) часто переезжают из одного медцентра в другой. В таких случаях секвенирование легко позволяет выявить происхождение вспышки, вызванной тем же патогеном, что ранее был выявлен в другой больнице, и персонал медучреждения может оперативно принять меры. Секвенирование на месте и помощь экспертов-биоинформатиков из референсной лаборатории позволяет получить результат в течение даже не часов, а минут.

На секции под названием «Метагеномика — инсайты без культуры» (Metagenomics — insights without culture) Лара Урбан из Цюрихского университета выступила с докладом «Squiggles to the rescue: metagenomics-based pathogen surveillance». Загогулинами (squiggles) специалисты по нанопору называют сырые данные секвенирования.

Длинные прочтения, возможность анализа в реальном времени и портативность установки позволяют использовать такое секвенирование в клинической практике, например, для обнаружения патогенов. Обычно, чтобы идентифицировать патоген, его культивируют, анализируют с помощью масс-спектрометрии, определяют видовую принадлежность и чувствительность к противомикробным препаратам. Иногда спустя недели образец посылают на секвенирование, но эту информацию уже обычно не применяют в клинике.

Исследователи продуктов проверяли, достаточно ли нанопоровое секвенирование точно, чтобы его использовать для определения патогенов, связанных с безопасностью. Данные нанопора были сходными с теми, что получили на приборах Illumina и получили схожие результаты. Такая же картина наблюдалась в клинике, где нанопоровое секвенирование сравнивали со стандартными методами определения микроорганизмов и выявления их антимикробной чувствительности.

С помощью нанопорового секвенирования проанализировали вспышку в больнице в Мюнхене, предположительно вызванную бактерией Citrobacter, резистентной к карбапенемам. За год было выявлено 10 случаев; бактерию также выделяли из раковин в палатах больных. Однако традиционные методы не могут подсказать, связаны ли эти случаи, а нанопоровое секвенирования подтвердило связь для шести случаев. Это значит, что передача бактерии шла внутри больницы, вероятно, из-за биопленок в раковинах. Также секвенировали плазмиды и между ними также показали связь.

Нанопоровое секвенирование позволяет уйти от культивирования к метагеному, то есть секвенированию всей ДНК в образце. Такой подход группа докладчицы уже использовала для эпиднадзора у животных в Новой Зеландии, выявлении патогенов в окружающей среде (в воздухе, воде).

Но это все были предварительные исследования. У метагеномики есть ограничения, которые не дают внедрять ее в практику по эпиднадзору — проблема чувствительности, особенно для низких концентраций патогенов, определения жизнеспособности и метаболической активности патогенов. А если найдены гены, связанные с резистентностью к антимикробным препаратам, хотелось бы знать, какие конкретно микроорганизмы их несут.

Для повышения чувствительности можно отметать все прочтения, которые нельзя картировать на интересующие нас референсы. Ученые опробовали квазиметагеномный подход — нанопоровое секвенирования после некоторого обогащения образца — для выявления патогена продуктов питания Listeria monocytogenes. Однако обогащение увеличивало количество только двух штаммов из четырех и занимало довольно много времени.

Были получены предварительные данные, показавшие, что для определения жизнеспособности можно использовать сигнатуры деградации, оцененные по сырым данным нанопорового секвенирования.

Определить, кому принадлежат гены устойчивости к противомикробным препаратам, особенно находящиеся на плазмидах, можно с помощью эпигенетики.

Камиль Ханипов из Техасского университета рассказал, как его группа характеризовала воздух. Сейчас в проекте участвует около 30 лабораторий, которые предоставляют образцы, собранные примерно в 200 локациях в США (внутри помещений и снаружи) в разные времена года, а также во время различных событий, сопровождаемых скоплениями людей, таких как Бостонский марафон или Марди Гра.

Все образцы собирали одинаковыми приборами — Hi-Q PSU-2 sampler (100 л/мин, 24 часа). Фильтры на льду отправляли в лабораторию, где хранили при -80. После экстракции нуклеиновых кислот на матрице РНК получали кДНК, после чего ДНК и кДНК подготавливали к секвенированию на PromethION с помощью Rapid PCR Barcoding Kit. Всего получили 921 ДНК-библиотеку и 879 кДНК-библиотек.

В докладе представлены только общие данные для 10 регионов материковой части США. Оказалось, что в воздухе очень много растительной материи — от трети до половины прочтений картировались на геномы растений. «Я понятия не имел, что мы будем тратить половину наших проточных ячеек, чтобы секвенировать растения. Я не этого хотел и не этим собирался заниматься», — сказал Камиль. Еще 30% прочтений приходилось на грибы, 10–30% — на бактерии, 0,1% — на вирусы. Были и сигналы, связанные с животными, но для анализа вся информация о человеческой ДНК отфильтровывалась.

Среди бактерий выделялись Escherichia и Pseudomonas. Доля сигналов растений и грибов зависела от того, шел ли недавно дождь. Ученые детектировали также вирусы, но, чтобы наблюдать таким образом за распространением патогенов, нужно секвенировать много и глубоко. Только тогда можно получить надежные результаты, а не ложноотрицательные.

По данным секвенирования очевидно было, что РНК в окружающей среде повреждается намного сильнее. Наиболее значительное влияние оказывали времена года.

Результаты этой работы доступны на сайте airmetagenomics.com.

Доклад Роберта Эдвардса из Университета Флиндерса (Австралия) назывался «RRR2 rapid respiratory response in rural and remote regions». Он был посвящен микробиому легких пациентов с муковисцидозом — при этом состоянии многочисленные тяжелые осложнения вызываются именно бактериальными инфекциями.

Когда Роберт Эдвартс работал в Сан-Диего, он и его коллеги разработали алгоритм действий, чтобы в течение 24 часов отобрать образец мокроты у пациента с муковисцидозом и острой инфекцией, секвенировать его и выдать результаты.

После переезда в Аделаиду он занялся хроническими инфекциями пациентов с муковисцидозом. У них тоже отбирали мокроту и секвенировали метагеном. Проблема в том, что при этом получается очень много данных, поэтому тяжело понять, что является драйвером заболевания. Так что для анализа используется искусственный интеллект, который группирует данные и генерирует кластеры связанных сиквенсов. Кластеры включают и таксономию, и функции. Также используют метод главных компонент.

Что важно для определения, например, Pseudomonas aeruginosa в образце мокроты? Разумеется, самое важное при определении Pseudomonas — это найти собственно Pseudomonas. Но есть и другие важные переменные, такие как множественной лекарственная устойчивость. Можно даже предсказать, какие индивиды с наибольшей вероятностью будут инфицированы P. aeruginosa в течение года.

Группа докладчика собирается повторить эту работу для бронхоэктаза. Это состояние, развивающееся после длительной инфекции, воспаления, повреждения легких, которые приводят к новым инфекциям, воспалению и т. д. В центральной Австралии частота встречаемости бронхоэктаза особенно высока. Цель проекта — повторить тот же 24-часовой алгоритм действий для нового заболевания. Но центральная Австралия очень большая, так что приходится возить секвенаторы в мобильных лабораториях.

На секции коротких докладов Талал Аль-Джазиди (Университет ОАЭ) рассказал о том, как с помощью нанопорового секвенирования выявили клинически значимые структурные варианты (SV) в геномах людей из стран Ближнего Востока и Северной Африки (MENA). Эти популяции слабо представлены в глобальных референсных базах данных.

Докладчик с коллегами получили первый подробный каталог SV для 61 человека из восьми стран MENA с использованием сверхдлинных прочтений Oxford Nanopore и средним покрытием генома 47х. Выравнивание выполняли на два референсных генома, GRCh38 и T2T-CHM13, причем последний («от теломеры до теломеры») улучшил результат. В итоге было идентифицировано 97 765 SV, из них около 20% ранее не были описаны, что показывает, как мало изучено геномное разнообразие региона.

Исследователи выявили популяционно-специфические варианты в генах, связанных с заболеваниями, фармакогенетикой и иммунными ответами. Путем сравнения с геномами шимпанзе и древних гоминин были выделены древние SV, как общие для людей современного типа, так и MENA-специфические.

Кили Монтгомери (Исследовательский институт деменции, Кембридж, Великобритания) представила протокол RAPID для анализа длинных прочтений РНК, позволяющий идентифицировать варианты сплайсинга при редких заболеваниях.

Эффективность молекулярной диагностики редких заболеваний в настоящее время вышла на плато — все еще не удается диагностировать примерно половину, в том числе из-за технических ограничений коротких прочтений и сложностей интерпретации вариантов неопределенной значимости (VUS). Основным источником недиагностированных случаев остаются варианты, изменяющие сплайсинг. РНК-секвенирование может стать «мостом», который помогает оценить клиническую значимость вариантов, обнаруженных при секвенировании ДНК.

Докладчица с коллегами создали рабочий процесс «от образца до результата» для таргетного секвенирования РНК с использованием технологий Oxford Nanopore. Подготовить образец можно в течение дня.

Процесс, который назвали RAPID (RNA Analysis Pipeline for Integrated Diagnostics) применили к шести клиническим случаям, в которых у пациентов подозревалось моногенное нейрометаболическое заболевание. В двух случаях исследователи подтвердили патогенное нарушение сплайсинга, в одном случае исключили кандидатный ген, на который указывало секвенирование ДНК, и еще а в трех случаях получили РНК-данные, которые определили приоритетные направления дальнейшего анализа ДНК.

Кумерен Говендер из Оксфордского университета рассказал о быстрой диагностике инфекций кровотока с помощью нанопорового секвенирования.

Пациенты с инфекциями кровотока часто погибают из-за задержек с идентификацией патогенов и выявлением чувствительности к противомикробным препаратам. Методы, основанные на культивировании, не могут идентифицировать некоторые патогены, не растущие в культуре.

Группа докладчика разработала алгоритм, который позволяет идентифицировать вид и выявить чувствительность патогена к противомикробным препаратам быстрее, чем методы с культивированием. Они случайным образом выбрали 210 положительных и 61 отрицательную кровяную культуру для секвенирования метагенома с помощью нанопорового секвенирования.

Чувствительность и специфичность метода достигли 100%. Нанопроровое секвенирование выявило патогены, которые «упустил» метод, связанный с культивированием, среди них были и некультивируемые. В то же время не все виды определялись одинаково хорошо.

Медиана времени тестирования — 3 часа 20 минут, что опережает рутинные методы по крайней мере на 10 часов. А данные по чувствительности к противомикробным препаратам можно было получить на 20 часов раньше рутинных методов.

Тест стоил около 100 долларов на образец, что сравнимо с ПЦР, но, вероятно, стоимость удастся снизить до 40 долларов. Докладчик отметил и ограничения: в исследовании использовались кровяные культуры, а не кровь напрямую от пациентов.

Больше видео с London Calling 2026