Потеря функции PD-L1 вызвала раннее развитие диабета 1 типа у брата и сестры

Сахарный диабет 1 типа (также известный как аутоиммунный диабет) — это заболевание, при котором иммунные клетки пациента ошибочно разрушают бета-клетки поджелудочной железы, вырабатывающие инсулин. Аутоиммунный диабет с началом в очень раннем возрасте встречается редко и может быть результатом множества генетических вариантов. Международный коллектив ученых проанализировал клинический случай такого раннего диабета и показал, что его способна вызывать редкая мутация, приводящая к полной потере функции белка PD-L1.

Авторы статьи провели исследование двух сиблингов: брата и сестры с установленным в неонатальном возрасте сахарным диабетом 1 типа. Кроме диабета, у брата были другие заболевания, как астма, аутоиммунный гипотиреоз, дефицит гормона роста и задержка умственного развития, в частности речевого. У сестры других клинических проявлений не было. У обоих сиблингов были выявлены крайне низкие уровни С-пептида, а результат анализа на аутоантитела к островковым клеткам был отрицательный, что указывает на полное отсутствие инсулина. Дальнейший анализ показал, что мать и оба сиблинга были гетерозиготны по HLA-гаплотипу DR4, который связан с риском развития диабета 1 типа, однако девочка также оказалась носителем гаплотипа DQ6, защищающего от развития этого заболевания. Учитывая чрезвычайно раннее проявление диабета у двух пробандов и их кровное родство, ученые предположили, что в основе их неонатального начала диабета лежит биаллельная мутация, присутствующая у и брата, и у сестры, или ранее не идентифицированный патогенный ген.

Полногеномное секвенирование показало, что оба пробанда являются носителями гомозиготного варианта в сплайс-сайте, который расположен в четвертом интроне гена CD274, кодирующего PD-L1. Последующие анализы CADD (combined annotation-dependent depletion) и SpliceAI предсказали высокую вероятность нарушения функций этого сплайс-сайта. Также у мальчика была обнаружена de novo дупликация в 7q11.23, которая была связана с неврологическими фенотипами, но не с аутоиммунными заболеваниями. Эта дупликация отсутствовала у его сестры, что, возможно, объясняет различия в их неврологическом развитии.

На основании этих наблюдений ученые предположили, что гомозиготный вариант сплайс-сайта CD274 может приводить к аутосомно-рецессивному дефициту PD-L1 и за счет этого вызывать диабет 1 типа с ранним началом.

Для того чтобы выяснить, влияет ли выявленный вариант на сплайсинг мРНК CD274, ученые использовали метод улавливания экзонов (exon-trapping assay). Векторы в этом анализе содержали геномную область, фланкирующую положение биаллельного варианта сплайс-сайта — мутантного или контрольного (дикий тип). В клетках HEK293T, несущих мутантный вариант, была выявлена делеция 153 оснований внутри рамки считывания белка.

В отличие от этого, трансфицированные диким типом клетки продуцировали два транскрипта: канонический и альтернативный с делецией в 106 оснований. Эта делеция 106 оснований приводила к сдвигу рамки считывания и к преждевременной терминации. Интересно, что оба транскрипта с делециями использовали один и тот же консенсусный мотив сплайс-сайта. Таким образом, вариант сплайс-сайта пациентов нарушал экспрессию канонической изоформы CD274. Исходя из этих данных, исследовательская группа предположила, что мутантный аллель CD274 приводит к экспрессии исключительно альтернативной изоформы PD-L1, несущей делецию внутри рамки считывания.

Предполагаемая изоформа, кодируемая выявленным транскриптом, должна иметь делецию из 51 аминокислоты во внеклеточном домене (изоформа PD-L1∆51). Эксперимент in vitro показал, что эта изоформа экспрессируется намного менее интенсивно, чем канонический вариант PD-L1, и не распознается двумя специфическими антителами против этого белка. Авторы сделали вывод, что дефектная изоформа продуцируется и транслоцируется на поверхность клетки неэффективно.

Далее ученые исследовали, сохраняет ли изоформа PD-L1∆51 способность ингибировать сигнал PD-1, рецептора иммунной контрольной точки. Для этого PD-L1∆51 оверэкспрессировали в клетках В-клеточной лимфомы Raji, а затем совместно культивировали с клетками Т-клеточной лимфомы HuT78, трансдуцированными PD-1. Результаты показали, что изоформа PD-L1∆51 не подавляет активацию PD-1⁺ клеток HuT78, что свидетельствует о полной потере функции (LOF). Этот фенотип наблюдался, даже когда изоформа PD-L1∆51 распознавалась атезолизумабом — антителом, которое нацелено на PD-L1 и блокирует его взаимодействие с PD-1. Поэтому авторы пришли к выводу, что изоформа PD-L1∆51 теряет функции из-за конформационного изменения, вызванного делецией 51 аминокислоты. Это позволяет предположить, что изоформа PD-L1∆51 может оказаться неподходящей мишенью для иммунотерапии, направленной на блокирование пути PD-1/PD-L1.

После этого исследователи изучили схему сплайсинга гена CD274 в клетках пациентов. С помощью секвенирования РНК авторы обнаружили, что в клетках пациентов используется исключительно альтернативный сайт сплайсинга, приводящий к делеции 153 оснований.

При изучении белка PD-L1 в клетках крови пробандов ученые обнаружили, что размер белка у детей отличается — он составлял 30 кДа, тогда как у здоровых людей — 40–50кДа. Такое изменение демонстрирует, что анализируемые пациенты являются носителями изоформы PD-L1∆51. Эта изоформа была единственной формой белка в клетках пациентов, и ее уровень был ниже нормы.

Исследователи проанализировали уровень белка PD-L1 на поверхности периферических мононуклеарных клеток крови (PBMC) брата и сестры с предполагаемым дефицитом PD-L1 и здоровых контролей.  Лейкоциты сиблингов демонстрировали очень низкий уровень экспрессии PD-L1 независимо от условий стимуляции клеток. Однако стимуляция анти-CD3/CD28 антителами вызывала небольшое увеличение экспрессии PD-L1 в промежуточных и неклассических моноцитах. Полученные данные объясняются экспрессией нефункциональной изоформы PD-L1 (PD-L1∆51) на поверхности клеток. Этот дефицит приводит к дисрегуляции развития лейкоцитов, характеризующейся снижением количества Vδ2+ γδ Т-клеток и NK-клеток, а также умеренным повышением активации Т-лимфоцитов. Репертуар Т-клеточных рецепторов (TCR) при этом не изменялся.

Авторы также сравнили фенотипические изменения при дефиците PD-L1 и при дефиците PD-1 — они проанализировали случай другой пары сиблингов. Оказалось, что дефицит PD-L1 слабее нарушал транскрипцию генов, связанных с аутоиммунитетом и аутовоспалением, чем дефицит PD-1. При этом унаследованные дефициты PD-1 и PD-L1 лежали в основе перекрывающихся транскриптомных изменений в Т-лимфоцитах и миелоидных клетках in vivo, несмотря на разницу в клинических аутоиммунных проявлениях и развитии лейкоцитов. Также наследственный дефицит PD-L1, как и PD-1, вызвал у пациентов умеренное нарушение продукции IFN-γ Т-лимфоцитами.

Описанный клинический случай полного наследственного дефицита PD-L1 продемонстрировал практически нормальное развитие лейкоцитов — это говорит об удивительной, по словам авторов, «ненужности» PD-L1 у человека. Оба сиблинга с дефицитом PD-1 погибли от аутоиммунной пневмонии в возрасте менее 12 лет, тогда как пациенты с нефункциональным PD-L1 нормально себя чувствуют на заместительной гормональной терапии — на момент написания статьи им 10 и 11 лет. Из этого следует, что не все PD-L1-экспрессирующие клетки имеют одинаковое патофизиологическое значение. Необходимы дальнейшие исследования для определения точной молекулярной и клеточной роли PD-L1-экспрессирующих клеток в контексте аутоиммунного диабета.


Бета-клетки с высокой экспрессией CD63 отвечают за развитие диабета