Предшественники адипоцитов быстро принимают решение о дифференцировке

Ученые из США отслеживали циркадные ритмы и дифференцировку линии клеток-предшественников адипоцитов О9. Они показали, что клетки принимают решение о начале дифференцировки в определенный 12-часовой промежуток времени, приходящийся на фазу отдыха. Ежедневные пики дифференцировки обусловлены экспрессией ключевого регулятора адипогенеза PPARG, которая подчиняется циркадным ритмам за счет белка CEBPA.

Внутренние часы организма контролируют метаболизм большинства млекопитающих. Ранее было показано, что проблемы с циркадными ритмами вызывают дерегуляцию дифференцировки иммунных, мышечных и других типов клеток. Но как именно быстрые циркадные осцилляции могут регулировать многодневный процесс клеточной дифференцировки, оставалось непонятным.

Вначале авторы разработали модель для одновременного мониторинга циркадных ритмов и прогресса дифференцировки в клетках. Ранее они опубликовали статью, где показали, что для детерминации дифференцировки необходимо, чтобы PPARG достиг определенного порогового значения. Используя CRISPR, исследователи создали двойную репортерную линию клеток-предшественников адипоцитов, где уровень эндогенного PPARG отслеживался с помощью цитрина (YFP), а циркадный ритм определялся через метку mScarlet (RFP), связанную с REV-ERBα. REV-ERBα, в свою очередь, обеспечивает циклическую экспрессию коровых белков циркадного ритма BMAL1 и CLOCK. Используя разработанную систему, ученые показали, что циркадный цикл данной линии равняется примерно 26 часам.

Чтобы определить, есть ли определенная фаза циркадного цикла, когда клетки необратимо уходят в дифференцировку, ученые наблюдали за клетками, подсчитывая время и интенсивность репортерных сигналов. Используя MATLAB-скрипт, исследователи построили график осцилляций REV-ERBα, далее перевели его в линейный и наложили временные точки достижения порогового уровня PPARG. Спроецировав более 13 тысяч точек, они определили, что детерминация происходит на 12-часовом участке цикла во время повышения уровня REV-ERBα.

Далее авторы хотели убедиться, что эта корреляция имеет биологический смысл и не является случайной. Они использовали глюкокортикоид дексаметазон, чтобы сдвинуть фазу на 12 часов, повторили график и увидели, что временные точки детерминации тоже сдвинулись, снова располагаясь на том же участке повышения уровня REV-ERBα. Также исследователи использовали малую молекулу LH846, которая удлиняет циркадный цикл таким образом, что пик REV-ERBα наступает позже. Время детерминации снова сдвинулись вместе с экспрессией REV-ERBα.

Когда связь между циркадными ритмами и детерминацией дифференцировки стала неоспоримой, ученые решили посмотреть, как именно происходит взаимодействие между белками. Так как ген PPARG не содержит в промоторе Е-боксов и, соответственно, не взаимодействует напрямую с белками циркадных ритмов, исследователи предположили, что роль в осцилляциях PPARG может играть CEBPA. Это белок положительной обратной связи, быстрый регулятор PPARG, необходимый для поддержки его экспрессии. В свою очередь, ген, кодирующий CEBPA, уже имеет два Е-мотива на промоторе. RT-PCR и иммунофлуоресцентный анализ показали, что экспрессия CEBPA тоже происходит с циркадными осцилляциями. Нокаут CEBPA привел к существенному снижению экспрессии PPARG и к общему снижению его циркадных осцилляций.

Положительная обратная связь PPARG осуществляется также и через медленный регулятор FABP4, время полужизни которого составляет 30 часов (против трех часов у CEBPA). FABP4 не влияет на поддержание циркадных осцилляций PPARG. Однако FABP4 и вариабельность клеток по экспрессии PPARG являются причинами, почему все пики дифференцировки не приходятся на один день. Эти два дополнительных фактора помогли ученым построить очень точную компьютерную модель адипогенеза с многодневными пиками и циркадными осцилляциями.

Авторы предполагают, что, зная время, на которое приходится пик дифференцировки клеток, можно положительно влиять на регенерацию тканей, планируя стратегию терапии.