Пробоподготовка для single-cell sequencing от 10x Genomics

Секвенирование единичных клеток технически сложнее, чем секвенирование тотальной РНК или ДНК образца. Но без него никак, когда речь идет о системных исследованиях гетерогенности, взаимодействия клеточных популяций и организмов. Прорыв в области секвенирования единичных клеток можно сравнить с изобретением микроскопа: он открывает ранее недоступный для изучения уровень организации живой материи.

Например, секвенирование ДНК отдельных клеток позволяет исследовать генетический мозаицизм и генетическую гетерогенность при канцерогенезе или при ответе опухоли на лечение. Секвенирование ДНК единичных клеток микробов помогает исследователям точнее собирать геномы и описывать физиологию некультивируемых микроорганизмов в бактериальных сообществах.

Если объединить возможности анализа единичных клеток и уже существующих методов NGS, это позволит проводить исследования с «клеточным» разрешением на популяционном и тканевом уровне. ATAC-seq анализ доступности хроматина основан на способности активной Tn5 транспозазы вставлять в активные участки хроматина адаптеры для NGS. Применение ATAC-seq для единичных клеток позволит выдвигать гипотезы о тканеспецифичной регуляции генома на уровне отдельных клеточных популяций.

Настоящую революцию совершили технологии исследования единичных клеток в транскриптомике. В последние годы растет доля опубликованных статей, в которых используется не анализ тотальной РНК, а single-cell транскриптомные исследования. ScRNA-seq активно применяют для изучения клеточной гетерогенности и эмбрионального развития, поскольку такой анализ показывает реальную экспрессию генов в каждой клетке, а не усредненную экспрессию в тысячах клеток.

 Количество статей в базе PubMed, найденных по запросу «RNA-seq» (синие столбцы) и «single-cell RNA-seq» (зеленые столбцы)

Что можно делать с помощью секвенирования РНК единичных клеток?

Искать пути к персонализированной терапии рака легких, аденокарциномы, почечной карциномы, сердечно-сосудистых заболеваний и других болезней, в патологию которых вовлечена клеточная гетерогенность.

Добавить дополнительные измерения в картины биологических процессов с учетом клеточной гетерогенности, расположив данные по осям пространственной направленности, времени и механизма.

Составлять транскриптомные атласы человека, исследовать старение у мыши, анализировать иммунный ответ на COVID-19 — и это далеко не все.

Как это делается?

Протоколы секвенирования единичных клеток включают получение отдельных клеток и выделение их нуклеиновых кислот, в случае scRNA-seq — обратную транскрипцию, амплификацию, создание библиотеки и собственно секвенирование.

Более трудоемкий процесс выделения отдельных клеток проводится с помощью рассаживания клеток по одной штуке в лунки планшета. Современные методы позволяют инкапсулировать отдельные клетки в капельки в микрофлюидном устройстве, где происходит также реакция обратной транскрипции, превращающая РНК в кДНК.

Американская компания 10x Genomics предлагает готовые решения для максимального упрощения пробоподготовки для NGS единичных клеток на платформе Illumina. Станция Chromium Controller была разработана для подготовки библиотек к высокопроизводительному анализу генома, транскриптома и экзома на уровне отдельных клеток. Дистрибьютор продукции 10x Genomics в России и СНГ — компания SkyGen; с техническими характеристиками станции можно ознакомиться на ее сайте.

Какие компоненты входят в состав системы?

Станция Chromium Controller, а также все необходимое для создания эмульсии единичных клеток, реагенты для обратной транскрипции, специальные чипы и реактивы для подготовки библиотек к NGS. Пользователи системы имеют доступ к программному обеспечению для обработки и визуализации полученных данных, разработанному 10x Genomics.

Что используется в качестве исходного образца?

Исходный образец для пробоподготовки — это суспензия живых клеток в буфере (например, в PBS или аналогичном). Суспензию помещают на чип, в микроканалах которого клетки проходят через масляный барьер и оказываются внутри эмульсионных капель с гелевыми частицами (Gel Bead-in-Emulsion, GEM). В гелевой частице, помимо клетки, находятся уникальные для каждой частицы олигонуклеотиды, позволяющие при подготовке библиотек помечать каждую отдельную клетку своим баркодом.

Устройство чипа Chromium Next GEM Chip для станции Chromium Controller. Credit: SkyGen

За счет чего обеспечивается мечение клеток индивидуальным баркодом?

В растворе, помимо гелевой частицы с олигонуклеотидами и клетки, содержатся реагенты для лизиса и обратной транскрипции. Поэтому при помещении эмульсионной капли в амплификатор мРНК будет высвобождаться из клеток и связываться с олигонуклеотидами, несущими поли-dT-хвост (30 нуклеотидов). Также олигонуклеотиды включают адаптер R1 для Illumina, уникальный для каждой гелевой частицы баркод 10X (16 нуклеотидов) и метку UMI (12 нуклеотидов).

 Схема обратной транскрипции с использованием праймеров, содержащих уникальные последовательности для мечения единичных клеток. Credit: SkyGen

Таким образом, все риды, полученные в результате секвенирования одной клетки, будут содержать одинаковые баркоды, не повторяющиеся от клетки к клетке. Чтобы правильно оценить уровень экспрессии отдельных генов с поправками на амплификацию в ходе пробоподготовки, используется метка UMI (Unique Molecular Identifier), которая уникальна для каждой молекулы олигонуклеотида внутри гелевой частицы.

Схема пробоподготовки образцов для секвенирования геномных и транскриптомных данных на уровне единичных клеток с помощью прибора Chromium Controller. Credit: SkyGen

Какие наборы реагентов для пробоподготовки доступны в России и СНГ?

В компании SkyGen можно заказать наборы и чипы для исследования 3'-экспрессии генов единичных клеток, 5'-экспрессии и профилирования иммунных клеток (с обогащением V(D)J-регионов), а также для ATAC-секвенирования — исследования доступности хроматина.

Для каких исследований может быть использована пробоподготовка с помощью станции Chromium?

Секвенирование единичных клеток нашло применение во всех областях биологии, но особенно широко оно используется при изучении иммунных клеток. Например, с его помощью можно исследовать опухолевое микроокружение или гетерогенность клеточного состава опухолей. Секвенирование V(D)J-регионов, а также анализ 5’-экспрессии генов позволяет идентифицировать клональность, разнообразие и фенотип инфильтрующих опухоль B- и T-клеток. А при помощи анализа CNV опухолевых клеток становится возможным идентифицировать редкие клеточные популяции для изучения клональной эволюции опухоли или для сравнения клеточного состава опухоли до и после терапии.

Сейчас конечно же актуально изучение иммунного ответа на коронавирусную инфекцию. При помощи технологий 10x Genomics в 2020 году исследователи из Китая получили данные о гетерогенности бронхоальвеолярных иммунных клеток у пациентов с COVID-19, а коллектив ученых из Германии проанализировал экспрессию ACE2 в разных отделах легких. Готовые решения от 10x Genomics помогают изучать иммунный ответ на коронавирусную инфекцию, а также исследовать клеточную гетерогенность и репертуары T- и B-клеточных рецепторов на уровне единичных клеток.

Какие инновационные решения для технологий NGS дополнительно предлагает компания 10x Genomics?

Сейчас уже доступна для заказа система Visium для изучения пространственной экспрессии генов. Главный компонент системы — это специальный слайд, на который помещают гистологический срез и визуализируют его обычным способом, при помощи микроскопа. В зоне размещения среза на подложке закреплены олигонуклеотиды для захвата транскриптов, содержащие известные последовательности баркодов, UMI и полиТ-хвосты (аналогично протоколу Chromium).Каждая зона захвата транскриптов содержит около 5000 групп олигонуклеотидов диаметром 55 мкм; на одну такую точку приходится от одной до 10 клеток гистологического среза. После пермеабилизации клеток мРНК покидают образец и связываются с олигонуклеотидами. Затем проводится синтез к ДНК и другие этапы подготовки библиотеки. По последовательности баркода становится понятно, в какой точке на слайде находилась клетка до пробоподготовки, и эту информацию можно сопоставить с микрофотографией слайда. Таким образом, с помощью технологии Visium и станции Chromium Controller удается не просто подготовить библиотеку данных об экспрессии единичных клеток, а еще и понять, как эти клетки были расположены в пространстве.

Партнерский материал