Проследить судьбу линий кишечной палочки помогут штрихкоды в геномах

Новую технологию штрихкодирования бактериального генома разработала исследовательская группа из университета Бен-Гуриона (Израиль), Гарвардского университета (США), Института интегративной биологии в Цюрихе, и университета Монреаля, (Канада). Один из возможных сценариев ее применения — тестирование антибактериальных препаратов. В этом случае важно иметь инструмент, позволяющий отслеживать возникновение de novo мутаций устойчивости или вероятность передачи уже существующих мутаций. Однако детальное изучение эволюционных процессов до сих пор остается проблемой, особенно в больших бесполых популяциях, в которых возникающие мутации с низким фитнес-эффектом (влиянием на приспособленность) распространяются одновременно. Чтобы количественно охарактеризовать эволюционную динамику, требуется отслеживать большое количество отдельных генетических линий, большинство из которых возникают с крайне низкой частотой параллельно в течение нескольких поколений. Полногеномное секвенирование (WGS) обычно не в состоянии обнаружить мутации, встречающиеся с частотой менее 0,1%.

Альтернативные подходы, увеличивающие разрешающую способность WGS, основаны на мечении хромосом штрихкодами (баркодами), которые затем могут быть идентифицированы с помощью секвенирования — например, использование системы рекомбинации Cre-loxP в клетках Saccharomyces cerevisiae. Метод хорошо зарекомендовал себя на эукариотах, однако у бактерий количество уникальных баркодов, которое удавалось встроить в геном, оставалось низким.

В новом исследовании для штрихкодирования использовали транспозон Tn7; этот подход позволил получить популяцию E.coli, несущую в геномах 10⁵-10⁶ хромосомных штрихкодов — 15-нуклеотидных случайных последовательностей.

Бактериальные клетки подвергли лабораторной эволюции путем серийного пассирования в присутствии субингибирующих концентраций двух антибиотиков: хлорамфеникола и триметоприма. Бактерии часто подвергаются воздействию антибиотиков в концентрациях ниже минимальной ингибирующей (MIC), и важно исследовать эволюционную динамику в таких условиях, в частности, чтобы понять механизмы возникновения устойчивости.

Авторы ожидали увидеть, с одной стороны, отбор по признакам, полезным в присутствии конкретного антибиотика в определенной концентрации, с другой — по признакам, полезным в обычных лабораторных условиях; они также хотели выяснить, будет ли улучшение в одном направлении сопровождаться ухудшением в другом. Устойчивость к антибиотикам (увеличение концентрации, ингибирующей 50% роста) возрастала в популяциях, культивируемых при концентрациях антибиотиков 1% MIC, при этом действительно снижалась скорость роста в отсутствие антибиотиков. В популяциях, которые росли при сверхнизких концентрациях (0,1% MIC), устойчивость не возрастала, траектории скорости роста для них были аналогичны контролю, который рос в отсутствие антибиотиков. Но интересно, что в популяциях, растущих при концентрации триметоприма 0,1% MIC, увеличение скорости роста в среде без антибиотиков отставало от контроля: происходило некоторое снижение адаптации к нормальным условиям.

Чтобы проследить эволюционную динамику популяций, авторы секвенировали их штрихкоды и собрали частотные траектории для всех 450 000 исходных линий. Выяснилось, что в каждой из популяций доминировали одна-две линии, причем некоторые набрали высокую частоту в нескольких независимых популяциях бактерий. Частота отдельных линий могла сначала увеличиваться, а затем снижаться при конкуренции с более приспособленными. Скорость потери разнообразия клонов была сходной в сходных условиях и различной — в разных; это подразумевает, что динамика линий на уровне популяции определялась отбором, а не нейтральной динамикой (генетическим дрейфом).

Самый быстрый коллапс разнообразия наблюдался при 1% MIC хлорамфеникола: менее чем за 50 поколений исчезло более 90% уникальных штрихкодов. К концу эксперимента в каждой популяции преобладали от одной до пяти линий, тем не менее сохранялось несколько тысяч штрихкодов.

Популяции, растущие при сверхнизкой концентрации триметоприма (0,1% MIC), теряли разнообразие даже медленнее, чем контроль. Авторы предполагают, что в этих условиях уменьшается коэффициент отбора полезных мутаций (что может быть причиной и более медленного роста при нормальных условиях). Ранее было показано, что в малых дозах антибиотики могут действовать не как оружие, а, скорее как сигнальные молекулы, активирующие транскрипцию некоторых генов, в том числе участвующих в биосинтезе аминокислот, рибосомных белков и азотистых оснований. Триметоприм, как известно, влияет на транскрипцию, и в сверхнизких концентрациях, вероятно, может привести к сдвигу распределения полезных мутаций.

Авторы отмечают, что их метод позволяет изучать воспроизводимость эволюционных процессов в популяциях патогенов и то, в какой степени они детерминированы при тех или иных условиях. «Мы предполагаем, что этот инструмент найдет широкое применение для решения разнообразных вопросов о популяциях бактерий и эволюционной динамике», — пишут они в заключение.