Противоопухолевые экзосомы можно получать in vitro

Американские исследователи создали микрофлюидную систему для выделения натуральных киллеров (NK) на чипе, их культивирования и последующего сбора экзосом.

NK — клетки врожденного иммунного ответа — могут убивать озлокачествленные клетки, поэтому их используют в иммунотерапии опухолей. Однако в некоторых случаях сложно доставить необходимое количество NK к опухоли из-за недостаточно эффективного таргетинга и низкой способности преодолевать физиологические барьеры (например, гематоэнцефалический).

В настоящее время идет разработка протоколов использования экзосом NK-клеток. Экзосомы более стабильны, лучше проходят через барьеры, менее иммуногенны, их проще модифицировать в сравнении с NK. Тем не менее, с технической точки зрения сложно выделить чистую популяцию живых NK и получать из них специфические экзосомы.

Для решения этой проблемы авторы новой работы использовали микрофлюидный чип из оксида графена, связанный с антителами к CD56 — маркеру NK. Чип изолировал 95% NK из буфера. Ученые также показали, что большинство клеток сохранили жизнеспособность сразу после изоляции и после 12 часов инкубации на чипе.

Культивируя клетки на планшетах, исследователи определили, что с точки зрения количества экзосом и чистоты их фракции 12 часов — оптимальное время инкубации. В случае клеток на чипе скорость синтеза экзосом и их чистота оказались выше. Концентрацию экзосом оценивали посредством анализа траектории наночастиц (NTA, nanoparticle tracking analysis).

Экзосомы выделяли из супернатанта NK, собранных на чипе, с помощью магнитных бусин (ExoBeads), конъюгированных с антителами к CD63 — белку экзосомальной мембраны. Коньюгация происходит за счет иммобилизованного на бусинах стрептавидина, с которым связывается дестибиотин (D-биотин), подшитый к антителам. Для отщепления антител, изолировавших экзосомы, к бусинам добавляют биотин, который конкурентно замещает D-биотин на стрептавидине. Авторы подобрали оптимальную концентрацию наночастиц, количество D-биотинилированных антител, концентрацию биотина и время инкубации с ним для эффективного высвобождения экзосом.

Далее исследователи проверили, как NK-экзосомы взаимодействуют с линией циркулирующих опухолевых клеток (CTC). Экзосомы колокализовались с клетками и их мембраной, прижизненные наблюдения показали активный захват. Cпустя трое суток после начала инкубации большинство клеток погибло, что говорит о цитотоксичности экзосом.

После этого авторы протестировали систему на образцах крови, полученных от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) и здоровых доноров. В крови пациентов было больше NK-клеток, концентрация NK-экзосом и их доля в экзосомной фракции также была выше в сравнении с контролем. Авторы полагают, что более интенсивная секреция NK-экзосом связана с большей степенью активации NK у пациентов. Интересно, что экзосомы, полученные от здоровых пациентов, были более цитотоксичны.

Из крови пациентов с четвертой метастазирующей стадией НМРЛ исследователи выделили CTC и оценили корреляцию их количества с числом NK-клеток и их экзосом. Корреляция оказалась отрицательной: чем меньше NK, тем больше CTC. Однако корреляция между количеством CTC и NK-экзосом была положительной. Относительная цитотоксичность последних была также связана с числом CTC. Авторы полагают, что при увеличении количества CTC NK-клетки активируются, за счет чего выделяется больше токсичных экзосом.

Авторы считают, что разработанная ими микрофлюидная система может улучшить не только терапию, но и диагностику рака и прогнозирование исхода за счет точного фенотипирования иммунных клеток. Кроме того, систему можно использовать для изучения роли экзосом в онкологических и других заболеваниях.