Разработан метод для оценки возраста молекул РНК

Американские ученые разработали метод для оценки возраста отдельных молекул РНК в ходе РНК-секвенирования. Основу метода составляет внесение инозиновых меток с помощью редактирования РНК аденозиндезаминазой ADAR2.

Credit:
molekuul | 123rf.com

Метод секвенирования РНК единичных клеток сам по себе дает относительно немного информации о динамике экспрессии генов. В новой статье, опубликованной в Nature Biotechnology, сообщается о разработке нового метода, позволяющего в ходе секвенирования РНК определять возраст отдельных молекул РНК. Идея метода состоит во внесении в РНК временных меток с помощью аденозиндезоминазы ADAR2, сшитой с капсидным белком фага MS2.

Авторы метода предлагают пришивать к интересующим молекулам РНК специальную последовательность (тэг). В этой последовательности в течение существования РНК будут постепенно накапливаться остатки инозина, полученные из аденина под действием каталитического домена аденозиндезаминазы ADAR2. Доставку аденозиндезаминазного домена к тэгу осуществляет сшитый с ним капсидный белок вируса MS2 — для этого в тэг вводится последовательность, распознаваемая этим белком. Превращение аденина в инозин, катализируемое химерным белком ADAR2-MS2, впоследствии может быть выявлено как точечная замена аденина на гуанин.

Для калибровки системы ученые культивировали клетки линии HEK293T, экспрессирующие систему ADAR2-MS2. Тэг, в который вносятся временные метки, включили в состав 3’-некодирующей области мРНК, кодирующей флуоресцентный белок (известно, что эта мРНК не разрушается в клетках млекопитающих на протяжении как минимум 12 часов). Далее транскрипцию в клетках остановили с помощью актиномицина D, лизировали клетки и произвели секвенирование тотальной РНК. Анализ РНК показал, что, действительно, с течением времени молекулы РНК с тэгом подвергались редактированию, а по числу актов редактирования можно оценить возраст молекулы РНК с 95% доверительным интервалом 2,7 ± 0,4 часа. Авторы исследования разработали алгоритм, который выводит транскрипционную программу (функцию, которая описывает количество временных меток в зависимости от времени) для каждой РНК на основе накопления в ней следов редактирования.

Исследователи продемонстрировали, что разработанный ими метод может применяться и для изучения таких пластичных процессов, как активность нейронов, с временным разрешением. Они показали, каким образом изменяется экспрессия белка c-Fos в первичной культуре нейронов гиппокампа под действием хлорида калия. Более того, новый метод для оценки сроков жизни молекул РНК может применяться и на одиночных клетках. Остается, однако, неясным, будет ли калибровка временной шкалы, полученная для одной клеточной системы на основании следов редактирования РНК, работать для других систем.

Источник

Rodriques, S.G., Chen, L.M., Liu, S. et al. // RNA timestamps identify the age of single molecules in RNA sequencing. // Nature Biotechnology, 2020, DOI: 10.1038/s41587-020-0704-z

Добавить в избранное

Вам будет интересно