Разработан новый метод направленной эволюции бактерий

Новая модификация метода направленной эволюции позволяет получать клетки с комплексными фенотипами, обусловленными сочетанием генов. Метод основан на использовании умеренных бактериофагов, которые переносят между клетками плазмиды, содержащие множество генов, и активируемых фагов-хелперов, запускающих лизис после накопления мутаций.

Credit:

mackoflower| 123rf.com

Направленная эволюция имитирует процесс естественного отбора: чтобы получить живую систему с нужными свойствами (например, бактерию, устойчивую к антибиотикам), создаются вариации последовательности интересующего гена, производится отбор на нужные свойства, как правило, in vivo, затем на основе перспективных вариаций создается новая библиотека последовательностей для следующего раунда отбора. Такой подход особенно полезен в тех случаях, когда неизвестна связь тех или иных последовательностей с интересующими свойствами.

Однако большинство методов направленной эволюции подразумевает манипуляции с фрагментами ограниченной длины, поэтому с их помощью трудно создавать фенотипы, обусловленные многими генами. Ученые из Университета Северной Каролины (США) разработали метод направленной эволюции, который позволяет получать бактериальные клетки с желаемыми комплексными фенотипами. Статья о новом методе, получившем название IDE (от Inducible Directed Evolution), опубликована в журнале Nucleic Acids Research.

Основу IDE составляет заражение клеток умеренными (лизогенными) фагами, которые несут плазмиды с генами, отвечающими за желаемый биохимический путь. Геномы фагов достаточно велики, так что все эти гены вводят в состав одной плазмиды, в которой имеется сигнал для упаковки в фаговые частицы. Этой плазмидой (точнее, фагмидой) трансформируют бактериальные клетки, инфицированные вспомогательным фагом-хелпером, который в нужный момент вызывает лизис. Жизненным циклом фага-хелпера можно управлять: лизис клетки включается добавлением определенного вещества. Бактерии также содержат активируемую плазмиду мутагенеза.

После успешной трансформации бактериальной клетки фагмидой следует этап внутриклеточного мутагенеза, в последовательность вносятся случайные мутации. Далее индуцируется литический цикла фага-хелпера, в ходе которого фагмиды упаковываются в вирусные частицы, а клетки лизируются. Полученные частицы, содержащие фагмиды, можно использовать для инфицирования незараженных клеток и последующего скрининга их свойств, чтобы определить влияние мутаций, внесенных на предыдущем шаге в фагмиды. Использование лизогенного фага, несущего последовательность, и лизирующего фага-хелпера, который включается по желанию экспериментатора, дает достаточно времени для мутагенеза и скрининга. Чтобы провести следующий раунд мутагенеза, вирусными частицами с фагмидами инфицируют новые клетки, зараженные хелперным фагом.

В качестве фага-хелпера авторы выбрали P1, который заражает преимущественно кишечную палочку Escherichia coli. Переход этого фага с лизогенного цикла на литический находится под контролем двух генов: ген c1 подавляет лизис, а ген coi кодирует репрессор c1, поэтому для запуска литического цикла необходима оверэкспрессия coi; она включается добавлением арабинозы.

Ученые продемонстрировали эффективность нового метода на примере метаболического пути поглощения углевода тагатозы, ферменты которого кодируются пятью генами у бактерии Bacillus licheniformis. Путь удалось внедрить и адаптировать под клетки E. coli всего за два раунда мутагенеза: у трансформированных клеток E. coli лаг-период при росте в среде с тагатозой сократился на 65%. Обычно E. coli неохотно метаболизирует тагатозу.

Кроме того, авторы работы сумели внедрить в клетки кишечной палочки путь из десяти генов, взятый у бактерии Bifidobacterium breve UC2003, который дает клеткам возможность усваивать мелезитозу. После трех раундов IDE лаг-период при росте клеток на среде с мелезитозой сократился вдвое, а финальная оптическая плотность культуры выросла на 150%.

«Предыдущие методы направленной эволюции позволяли реконструировать до трех генов одновременно, — говорит руководитель работы Натан Крук. — Наш подход позволяет изменять до 30 генов одновременно. Кроме того, он лучше поддается автоматизации, чем предыдущие методы, что делает процесс значительно менее сложным и трудоемким».

Источники

Ibrahim S Al’Abri et al. Inducible directed evolution of complex phenotypes in bacteria // Nucleic Acids Research, gkac094, Published 12 February 2022, DOI: 10.1093/nar/gkac094.

Цитата по пресс-релизу

Добавить в избранное

Вам будет интересно