Разработан новый метод выделения РНК из образцов, фиксированных формалином

Пространственный анализ экспрессии генов в тканях — важный инструмент как для описание функций тканей, так и для идентификации патологических изменений. С распространением NGS ученые отошли от методов FISH и MERSFISH и стали чаще секвенировать РНК из образцов, преимущественно фиксированных при помощи мгновенной заморозки (FF). Такой метод фиксации позволяет получать РНК высокого качества, однако FF требует особых условий при длительном хранении и не позволяет проводить морфологический анализ. Образцы для морфологического анализа обычно фиксируются при помощи формалина с дальнейшим заключением в парафин (FFPE). Такие образцы могут храниться при комнатной температуре, однако происходящее в процессе фиксации связывание белков и нуклеиновых кислот значительно снижает качество РНК. Ученые из Японии разработали новый протокол для эффективного точечного секвенирования РНК из FFPE-тканей.

В предыдущих работах авторы представили прибор для получения микро-панчей тканей диаметром 100 мкм из срезов тканей толщиной 10–20 мкм. Ученые назвали подобные образцы PuTi-spots (micro-punched tissue spots). PuTi-spots обычно состоят из 10–50 клеток и могут быть получены как из FF, так и из FFPE-тканей.

В качестве образцов для тестирования нового протокола использовались ткани печени мышей. Ученые анализирование выделение РНК из FF-тканей, хранившихся два года при температуре -80°C, и FFPE-тканей, фиксированных 4% формалином и хранившихся заключенными в парафин при 4°C в течение двух лет.

Для получения референсных значений ученые секвенировали РНК из обоих образцов с использованием коммерческих наборов производства QIAGEN. Секвенирование проводилось из срезов тканей толщиной 100 мкм. Для снижения вариации экспрессии генов, связанной с пространственным расположением отобранных образцов, ученые использовали последовательную серию срезов. Полученную РНК разбавляли перед секвенированием до значений 5, 50, 500 и 5000 пг РНК на образец. Их выбрали для охвата возможных значений количества РНК, которые ученые ожидали получить при выделении РНК из PuTi-spots.

Количество прочтений для обеих тканей составило 0,6 миллионов. Анализ экспрессии генов показал, что доля прочтений, отнесенных к белок-кодирующим генам, выходила на плато в 80% при использовании 500 пг РНК для FF-тканей и 5000 пг для FFPE-тканей. Анализ числа молекул, задействованных в получении кДНК, показал, что оно также отличалось в десять раз. Такие данные свидетельствуют о большем уровне деградации РНК в FFPE-образцах.

Для выделения РНК из PuTi-spots ученые отбирали десять панчей из срезов печени. Образцы брали из одной области среза для снижения пространственной вариации в экспрессии генов. Каждый панч содержал 10–50 клеток. FFPE-образцы перед выделением РНК очищались от парафина. FF-образцы после получения срезов фиксировались 99,5%-ным этиловым спиртом для предотвращения деградации РНК. Выделение РНК проводилось по следующему протоколу: разрушение клеточной стенки при помощи протеиназы К с дальнейшей очисткой РНК при помощи магнитных бусин, несущих поли-Т праймеры. Для FFPE-образцов перед очисткой РНК проводилась температурная обработка для разрушения связей, образованных при фиксировании.

Среднее количество генов, обнаруженных в одном PuTi-spots, составило 8688 для FF-образцов и 7066 для FFPE-образцов. Количество молекул, задействованных в образовании кДНК, было на порядок выше для FF-образцов по сравнению с FFPE-образцами, что соотносится с референсным экспериментом.

При анализе экспрессии генов ученые обнаружили, что FF и FFPE-образцы расходятся на две четкие группы в анализе главных компонент (PCA) вне зависимости от метода выделения. Таргетный анализ экспрессии десяти генов показал, что семь из них различаются по уровню экспрессии в зависимости от метода фиксации. Выравнивание полученных прочтений для данных генов показало значительное снижение количества выравненных фрагментов после отметки в 500 нуклеотидов от 3’ конца гена для FFPE-образцов. Такие результаты свидетельствуют о том, что большинство молекул РНК в FFPE-образцах деградировали до длинны в 500 нуклеотидов и менее.

Наконец, ученые испытали новый протокол на образцах FFPE тканей рака легкого и здоровых тканей, полученных от пациентов и хранившихся в течение шести лет. Авторы идентифицировали 4400 генов в тканях рака и 1800 генов в здоровых тканях. Они также обнаружили более высокий уровень вариации в экспрессии генов между образцами, отобранными из тканей рака, по сравнению со здоровыми тканями.

Таким образом, ученые представили новый эффективный способ выделения РНК из малого количества ткани, фиксированной различными способами. Они считают, что применение нового метода позволит получить большой объем новой информации за счет привлечения коллекций фиксированных образцов к анализу РНК. Также ученые указывают на то, что малое количество материала, требуемое для нового метода, может значительно увеличить количество информации, получаемой при анализе клинической биопсии, без изменения количества отбираемой ткани.

Интеграция данных пространственной транскриптомики и секвенирования РНК единичных клеток: цели и методы