Разветвленные липиды в составе липидных наночастиц повышают эффективность доставки лекарства в клетку

При попадании в клетки липидные наночастицы, несущие терапевтические макромолекулы, оказываются в эндосомах. Если они не смогут выбраться из них, то «груз» разрушится и не выполнит свои функции. Ученые из Пенсильванского университета (США) показали in vitro и in vivo, что улучшить эндосомальное высвобождение можно за счет внедрения в состав липидных наночастиц разветвленных ионизируемых липидов.

Изображение:
Новый липид.

Credit: 
Sylvia Zhang | Пресс-релиз

Самый популярный невирусный метод доставки терапевтических макромолекул в клетки — липидные наночастицы (ЛНЧ). Однако эффективность такой доставки может быть снижена из-за того, что «груз» (например, мРНК) не может покинуть эндосомы после попадания в клетку. Ученые из Пенсильванского университета (США) повысили эффективность доставки «груза» за счет улучшения эндосомального освобождения, добавив в состав ЛНЧ разветвленные ионизируемые липиды — BEND (branched endosomal disruptor).

Авторы получали ионизируемые липиды в одну стадию, смешивая моно- или полиамины с эпоксидами разной длины. В основном ученые использовали полиамин 494 и применяли разветвленные эпоксиды разной длины и типа разветвления. В результате авторы получили набор из 12 BEND, а из них — ЛНЧ. В качестве положительного контроля использовали ЛНЧ с линейными ионизируемыми липидами, а также одобренные FDA или коммерчески доступные ЛНЧ. Эффективность трансфекции мРНК или белка проверяли как in vitro, так и in vivo.

Сначала ученые провели трансфекцию клеток HeLa с помощью BEND ЛНЧ, несущих мРНК люциферазы. Эффективность трансфекции повысилась в 10 раз по сравнению с ЛНЧ с линейными ионизируемыми липидами, при этом BEND ЛНЧ не были токсичными. После этого ЛНЧ вводили внутривенно мышам, измеряя флуоресценцию органов через 12 часов. В качестве положительного контроля использовали коммерчески доступные ЛНЧ с похожим аминовым ядром и линейными ионизируемыми липидами — C12-200, так как они считаются «золотым стандартом» для трансфекции и имеют тропизм к печени. Эффективность трансфекции для ЛНЧ с линейными и разветвленными ионизируемыми липидами в целом не различалась. Все ЛНЧ в основном попадали в печень, причем шесть BEND ЛНЧ из 12 трансфицировали клетки либо лучше, чем C12-200, либо на том же уровне.

После этого авторы создали еще одну панель из шести ЛНЧ с ядром из полиамина 200, как в C12-200, потому что такой состав повышает тропизм к печени. BEND ЛНЧ с восемью атомами углерода в 2–3 раза эффективнее трансфицировали клетки HeLa по сравнению с C12-200. Все BEND ЛНЧ с ядром 200 более эффективно доставляли мРНК как в печень, так и в другие органы, если сравнивать с C12-200, а также с SM-102 и ALC-0315 — ЛНЧ для вакцин, которые используют Moderna и Pfizer/BioNTech. Так, сигнал флуоресценции в печени был в пять раз выше. Наиболее эффективными ЛНЧ в этой группе оказались E4s-200 (четыре атома углерода, ветвление по типу втор-бутила), E4i-200 (четыре атома углерода, ветвление по типу изопропила) и E8i-200 (восемь атомов углерода, ветвление по типу изопропила).

Далее исследователи проверили эффективность трансфекции при генной терапии. Они использовали мышиную модель транстиретинового амилоидоза. Причина этой болезни — оверэкспрессия транстиретина (TTR) в печени, в результате чего белок образует амилоидные фибриллы. Для лечения есть препарат ONPATTRO, однако чаще всего пациентам требуется несколько инъекций. В исследовании авторы доставляли с помощью ЛНЧ мРНК Cas9 и гидовую РНК для нокаута TTR. При доставке этих молекул в ЛНЧ C12-200 уровень TTR снизился на 80%, а при использовании BEND ЛНЧ — на 80–90%. Наименьшая гепатотоксичность наблюдалась при использовании ЛНЧ E4i-200 и E8i-200.

Основываясь на результатах этих экспериментов, ученые попытались выявить корреляцию между физико-химическими свойствами ЛНЧ и эффективностью трансфекции. Однако корреляции выявить не удалось.

Более высокую эффективность трансфекции при использовании BEND ЛНЧ ученые объяснили тем, что такие ЛНЧ лучше покидают эндосомы. Это доказали как в экспериментах с искусственными эндосомами, так и с помощью симуляции молекулярной динамики. Разветвленные липиды, в отличие от линейных, лучше пронизывали мембрану эндосом, приводя к ее повреждению и позволяя «грузу» выйти наружу.

Ученые показали, что BEND ЛНЧ можно применять для доставки не только мРНК, но и белков. Так, они поместили в ЛНЧ рибонуклеопротин Cas9. Его ввели в составе ЛНЧ мышам линии Ai9, которые экспрессируют флуоресцентный белок tdTomato. Все BEND ЛНЧ более эффективно трансфицировали печень по сравнению с C12-200, причем эффективность E4s-200 была выше в 1,5 раза. Эти ЛНЧ трансфицировали более 10% гепатоцитов, что в два раза выше по сравнению с C12-200. Однако эффективность трансфекции легких была ниже, чем у C12-200. Другие BEND ЛНЧ также трансфицировали эпителий, иммунные клетки и эндотелий.

Используя BEND ЛНЧ с полиаминным ядром 494, ученые трансфицировали Т-клетки мРНК люциферазы. В отличие от ЛНЧ с линейными ионизируемыми липидами, BEND ЛНЧ были малотоксичны и при этом приводили к более высокой экспрессии люциферазы. Немного изменив состав ЛНЧ, ученые успешно трансфицировали более 80% Т-клеток. При этом более подробный анализ, при котором в Т-клетки доставляли мРНК EGFP, меченого Cy3, показал, что ЛНЧ попадают практически в каждую клетку.

Таким образом, ученые доказали, что внедрение ионизируемых липидов с разветвленной структурой в состав ЛНЧ может значительно повысить эффективность доставки генной терапии за счет улучшения эндосомального высвобождения.

Липидные наночастицы усовершенствовали с помощью химической эволюции

Источник:

Padilla M.S., et al. Branched endosomal disruptor (BEND) lipids mediate delivery of mRNA and CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complex for hepatic gene editing and T cell engineering. // Nature Communications (2025). DOI: 10.1038/s41467-024-55137-6

Добавить в избранное