Редактор оснований исправляет мутацию при неизлечимой форме муковисцидоза

Муковисцидоз — наследственное заболевание, сокращающее продолжительность жизни и поражающее более 100 000 человек во всем мире. Оно вызвано рецессивными мутациями в гене CFTR, который кодирует трансмембранный хлорный канал клеток секреторного эпителия. Муковисцидоз затрагивает множество систем организма, основная причина смертности при нем — поражение легких. 

Замена 1717-1G>A в гене CFRT — распространенная мутация сплайсинга, и вызванный ей муковисцидоз до сих пор считался неизлечимым. Группа под руководством итальянских ученых разработала метод коррекции этой мутации с помощью редактора адениновых оснований (ABE). 

Сначала авторы создали клеточную модель — они получили клетки HEK293, стабильно экспрессирующие мутантный вариант CFTR. Транскриптомный профиль соответствовал аномальному паттерну сплайсинга, связанному с патологией. Для нацеливания редактора ABE8 они использовали вариант SpCas9-NG, распознающий более короткую последовательность PAM (смежного с протоспейсером мотива), чем каноничный вариант. Наибольшая коррекция целевого участка составила 42%, однако доля редактирования соседних нуклеотидов также была существенной. 

Чтобы ограничить нецелевое редактирование, авторы протестировали другой вариант — ABE9, деаминазу с окном редактирования в 1–3 нуклеотида, — в комбинации с SpRY (версией SpCas9, практически не зависящей от PAM). Это снизило частоту целевого редактирования до 33%, однако замены в соседних нуклеотидах также стали возникать реже. 
Затем стратегию редактирования протестировали на первичных клетках эпителия бронхов человека (HBEC), полученных от пациентов с мутацией 1717-1G>A. Доставка конструкта с помощью лентивирусов обеспечила обнаружимый уровень редактирования, однако для снижения рисков внецелевой активности требовалось предотвратить длительную экспрессию. Поэтому вместо единого конструкта авторы доставили в клетки мРНК SpRY-ABE9 и гидовую РНК. Эффективность редактирования не превышала 2,8%. Авторы выяснили, что причина в особенностях структуры, и оптимизировали вносимую мРНК, что позволило добиться эффективности редактирования в 15%. 

Далее ученые оценили, насколько коррекция мутации 1717-1G>A восстанавливает функцию CFTR. Опыты проводили на терминально дифференцированных клетках псевдомногослойного эпителия на границе раздела воздух-жидкость. Через 2–3 недели после внесения редактирующей конструкции авторы инактивировали в клетках натриевый канал ENaC и стимулировали CFTR либо ингибировали его работу. Результаты подтвердили транспорт ионов хлора через этот канал, и его активность после редактирования была значимо выше, чем в контрольных клетках пациентов. При этом эффективность редактирования составила 16,4% (ее оценили по данным глубокого секвенирования), а нецелевых модификаций в двух соседних сайтах было меньше (4,2% и 1,9%).

У пациентов с муковисцидозом наблюдаются случаи компаундной гетерозиготности, при которой копии гена содержат различные мутации, в совокупности все равно приводящие к патологии. крайне важно избежать нежелательных модификаций второго аллеля, не содержащего 1717-1G>A. Авторы оценили аллельную специфичность разработанного конструкта на HBEC здорового донора. Целевая мутация в этом случае отсутствует, поэтому для оценки частоты редактирования ученые использовали соседние локусы, где выявили 0,24% и 0,28% редактирования. 

Наконец, исследователи оценили функцию отредактированного CFTR в ректальных органоидах, полученных из клеток пациента с компаундной гетерозиготной мутацией 1717-1G>A/F508del. Они измеряли степень набухания, индуцированного форсколином (FIS), и оценивали активность CFTR по изменению объема органоида. Отредактированные органоиды, обработанные форсколином, набухали сильнее, чем органоиды с неотредактированной мутацией, то есть фенотипически были ближе к дикому типу. 

Таким образом, редактирование адениновых оснований позволило точечно исправить мутацию 1717-1G>A, которая приводит к нарушению функции CFTR при муковисцидозе. Для заболевания, вызванного этой заменой, не существует одобренных методов лечения, однако авторы разработки полагают, что такое редактирование генома — перспективная стратегия для восстановления функции дефектного белка у пациентов. 

Микробиом детей с муковисцидозом «отстает в развитии»

Прайм-редактирование гена тРНК смягчает последствия нонсенс-мутации