Редакторы оснований замедлили удлинение тринуклеотидных повторов при болезни Гентингтона и атаксии Фридрейха

Известно больше 40 неврологических заболеваний, вызванных экспансией (удлинением последовательности) тринуклеотидных повторов в генах. Эти заболевания поражают примерно одного человека из 3000 в мире. Патогенные тринуклеотидные повторы могут располагаться как в кодирующих последовательностях генов, так и в некодирующих. Чем длиннее участок с повторами у конкретного пациента, тем раньше начинают проявляться симптомы заболевания и тем сильнее его проявления. Возможности терапии таких заболеваний крайне ограниченны.

Чаще всего такие заболевания вызваны полиглутаминовыми повторами. Например, причина болезни Гентингтона — повтор CAG в гене HTT, а атаксии Фридрейха — повтор GAA в интроне гена FXN. Эти повторы могут быть нестабильны и удлиняются в соматических клетках с возрастом, что сопровождается ухудшением симптоматики. Однако ученые из США предложили стратегию генной терапии болезней, вызванных тринуклеотидными повторами, с помощью редакторов оснований, которые бы прерывали повторы. Работа, результаты которой опубликованы в Nature Genetics, выполнялась под руководством Дэвида Лю — одного из создателей технологии редактирования оснований.

В литературе есть сведения о том, что если у пациентов с болезнью Гентингтона или одним из типов спиноцеребеллярной атаксии полиглутаминовый повтор содержит не только CAG, но прерывается синонимичным тринуклеотидом CAA, то заболевание проявляется в более позднем возрасте. В экспериментах на мышах также было показано, что если в полиглутаминовом повторе чередуются CAG и CAA, то сам повтор со временем не удлиняется, в отличие от повторов, состоящих только из CAG. Опираясь на эти наблюдения, исследователи решили использовать редактор цитозина, чтобы из повторов CAG получать CAA.

Сначала ученые оценили возможность такого редактирования, используя клеточную линию HEK293T, содержащую всего 17 повторов CAG в гене HTT. При трансфекции клеток редактором цитозина и гидовой РНК для него средняя эффективность редактирования составила 44-62%.

Следующие эксперименты исследователи провели на фибробластах пациентов с болезнью Гентингтона: в этом случае одна аллель HTT была дикого типа, а вторая несла 48–180 повторов CAG. Редактор оснований вместе с гидовой РНК вносили электропорацией, а через пять дней 66–82% клеток уже содержали прерванные повторы CAG. Эффективность редактирования была на 10–30% выше в патогенной аллели по сравнению с аллелью дикого типа, вероятно, потому, что именно в патогенной аллели редактор может связаться с большим количеством мишеней. Отредактированные фибробласты вели в культуре 30 дней, до достижения клеточного старения. В клетках, которые не были отредактированы, полиглутаминовый повтор удлинялся примерно на шесть CAG. В то же время у отредактированных фибробрастов никакого соматического удлинения не было: появление в этих повторах тринуклеотида CAA стабилизировало их.

Так как в геноме часто встречаются повторы CAG, исследователи проверили нецелевое действие редактора с помощью метода CIRCLE-seq. В геноме нашлось почти 6000 потенциальных мишеней для редактирования, около 10% из которых содержали больше 8 повторов CTG и идеально совпадали со спейсером в гидовой РНК. Среди этих альтернативных мишеней было 16 локусов, связанных с болезнями тринулеотидных повторов, а также еще 129 белок-кодирующих и 469 некодирующих локусов. Полногеномное секвенирование отредактированных клеток HEK293T подтвердило, что редактирование прошло почти в половине потенциальных мишеней. Большинство локусов кодировали полиглутаминовые или полилейциновые повторы, но замена получалась синонимичной (CAG—CAA, CTG—TTG). Дальнейший биоинформатический анализ показал, что такие миссенс-мутации в большинстве случаев оказывались доброкачественными, а потенциально опасные замены возникали в генах, которые не экспрессируются в нейронах.

Затем стратегию валидировали на мышиной модели болезни Гентингтона. Мыши линии Htt.Q111 содержат гуманизированную аллель HTT с 109–122 повторами CAG. Животным вводили в желудочки мозга два аденоассоциированных вируса (ААВ), несущих редактор цитозина и гидовую РНК. Ученые выбрали ААВ серотипа 9, так как для него характерен тропизм к нейронам. Эффективность трансдукции в коре мозга и полосатом теле составила около 50 и 31%. Через неделю после введения ААВ 24 и 5,6% всех клеток в кортексе и полосатом теле содержали тринуклеотиды CAA, прерывающие повторы CAG. Еще спустя 11 недель число этих клеток увеличилось до 33 и 22% соответственно, затем количество отредактированных клеток стабилизировалось. Если учитывать только трансдуцированные клетки, то к 24 неделям после редактирования 76 и 72% кортикальных и стриатальных нейронов содержали тринуклеотиды CAA. Благодаря редактированию средняя длина повторов CAG сократилась как в кортексе, так и в полосатом теле, причем эффект сохранялся в течение 24 недель.

Аналогичную стратегию ученые использовали и для атаксии Фридрейха. Известно, что если повтор GAA в первом интроне гена FXN прерывается триплетами GAG, то симптомы болезни не проявляются вовсе либо появляются гораздо позже. Исследователи предположили, что с помощью редактора аденина можно заменить некоторые триплеты GAG на GAA. Систему также сначала проверили на клетках HEK293T, содержащих 9 повторов GAA, и добились эффективности редактирования 42–45%. В отличие от предыдущих экспериментов, исследователи остановились на редакторе оснований, который не вносил одноцепочечные разрывы в ДНК, так как повторы GAA очень часто встречаются в геноме и большое число таких разрывов может нарушить его стабильность. Эффективность редактирования также оценили в мышиных эмбриональных стволовых клетках, несущих интрон 1 человеческого гена FXN с большим числом повторов GAA. Как и до этого, эффективность редактирования повышалась при увеличении числа повторов.

Повторы GAA встречаются в геноме в GA-островках, в том числе в составе Alu-элементов. В геноме более 600 локусов содержат как минимум 8 повторов GAA — в шесть раз больше, чем подобных локусов с повторами CAG. Поэтому особенно важно было оценить нецелевое действие редактора аденина. С помощью CIRCLE-seq ученые выявили почти 42 тысячи возможных мишеней, около 3000 из которых идеально совпадали со спейсерами гидовых РНК. Полногеномное секвенирование показало, что редактирование проходило в половине из выявленных локусов, однако в основном оно затрагивало интроны и другие некодирующие последовательности. По данным биоинформатического анализа, большинство миссенс-мутаций были доброкачественными, однако в четырех генах все-таки выявлены риски, связанные с фолдингом или функцией белков.

Наконец, стратегию протестировали на фибробластах, полученных от пациентов с атаксией Фридрейха и несущих 330-541 повторов GAA. В этом случае через пять дней в трети фибробластов наблюдали появление замен, а экспрессия FXN, которая может подавляться из-за повторов GAA, повысилась на 49–74% по сравнению с клетками дикого типа.

В качестве животной модели использовали линии мышей YG8s.300 и YG8s.800, которые несут человеческий ген FXN с 300 и 800 повторами GAA, соответственно. Этим мышам тоже вводили два ААВ серотипа 9. Через 24 недели была отредактирована треть кортикальных нейронов у мышей YG8s.300 и половина кортикальных нейронов у мышей YG8s.800. При редактировании GAA в основном заменялся на триплеты GGA. При этом средняя длина повторов GAA в кортексе после редактирования также снизилась.

Исследователи также разрабатывают другой подход к генной терапии этих заболеваний — замену участков с патогенными повторами на более короткое и стабильное количество повторов методом праймированного редактирования, сообщается в пресс релизе.

Антисмысловой олигонуклеотид остановил рост числа CAG-повторов в клетках пациента с болезнью Гентингтона