Рекомбинантные SARS-CoV-2 для отслеживания распространения вируса в организме

Новые рекомбинантные SARS-CoV-2 с флуоресцентным или люциферазным репортером экспрессируют полный набор коронавирусных белков. Гены репортеров встроены в одну рамку считывания с геном белка нуклеокапсида. Благодаря этому рекомбинантные коронавирусы воспроизводят свойства вируса дикого типа и обеспечивают сигнал, достаточный для ex vivo и in vivo визуализации.

Слева: В предыдущей работе исследователи из Texas Biomed попробовали заменить ген вируса на ген зеленого флуоресцентного белка, но экспрессия белка была недостаточной. Справа: в новом исследовании они вставили ген флуоресцентного белка рядом с наиболее экспрессируемым белком SARS-CoV-2, и это сработало очень хорошо. Каждое зеленое пятно соответствует одной вирусной частице.

Сredit: Texas Biomed | Пресс-релиз

В доклинических испытаниях и фундаментальных исследованиях коронавируса SARS-CoV-2 часто требуется определить локализацию вируса или его репликационную активность в организме модельных животных. Быструю детекцию может обеспечить белок-репортер. Ранее для изучения SARS-CoV был разработан рекомбинантный вирус с заменой последовательности белка ORF7a на ген репортера. Рекомбинантный SARS-CoV-2, сконструированный по такой же схеме группой под руководством ученых из Техасского биомедицинского исследовательского института, был неудачным из-за низкого сигнала репортера. Кроме того, нарушение природной последовательности и удаление ORF7a могло привести к непредсказуемому поведению вируса в экспериментах in vitro и in vivo.

В новой работе эта же команда описала два рекомбинантных SARS-CoV-2 — с флуорецентным белком Venus и люциферазным репортером Nluc, у которых сохранена экспрессия всех коронавирусных белков. Репортерный ген помещен в одну рамку считывания с геном белка нуклеокапсида. Это обеспечивает высокий уровень экспрессии репортера, так как белок нуклеокапсида — один из наиболее сильно экспрессирующихся белков коронавируса. Белки отделены друг от друга самовырезающимся пептидом 2A пикорнавируса PTV-1.

Для создания рекомбинантных вирусов использовали так называемую обратную генетическую систему. Она подразумевает сборку ДНК-последовательности, комплементарной желаемому геному вируса, in vitro транскрипцию и доставку полученной РНК в клетки для сборки рекомбинантных вирусов.

Рекомбинантный SARS-CoV-2 с флуоресцентным репортером воспроизводит вирулентность SARS-CoV-2 дикого типа в клетках Vero E6 и дает более сильный флуоресцентный сигнал, чем описанный ранее вирус с делецией ORF7a. При инфицировании мышей K18, экспрессирующих человеческий ACE2, титр рекомбинантного вируса через 1, 2, 4 и 6 дней после инфекции совпадал с титром вируса дикого типа. Воспроизводились также физиологические показатели мышей. Флуоресцентный сигнал был достаточным, чтобы провести ex vivo визуализацию вируса в клетках легких, и коррелировал с титром вируса.

Для наблюдений за динамикой вируса in vivo по той же схеме был создан SARS-CoV-2 с люциферазным репортером. Этот вирус также воспроизводил свойства вируса дикого типа на клетках и мышах. Сигнал был достаточным для неинвазивной in vivo визуализации вируса в тканях мыши после инъекции субстрата люциферазы. Однако на поздних стадиях (больше четырех дней от заражения) величина сигнала не коррелировала с титром вируса, вероятно, из-за накопления люциферазы.

Исследователи применили вирус с люциферазным репортером для оценки профилактической эффективности нейтрализующих антител. Они вводили мышам K18 антитело 1212C2 за 12 часов до заражения рекомбинантным вирусом. Об успешном подавлении размножения вируса свидетельствовало отсутствие люциферазного сигнала. Защитное действие антител подтвердил и гистологический анализ.

Репортерные рекомбинантные SARS-CoV-2 будут полезны как для исследования свойств коронавируса, так и для поиска средств против него. Новая разработка вызвала интерес у научных групп: авторы уже выслали рекомбинантные вирусы или их неинфекционные предшественники в более чем 100 лабораторий по всему миру.

Источник

Ye, C. et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. // PNAS, 118, 41, 2021; DOI: 10.1073/pnas.2111593118

Пресс-релиз

Добавить в избранное

Вам будет интересно