РНК-интерференция подавила устойчивость патогена к антибиотикам в организме мыши

Проблема множественной антибиотикорезистентности бактерий стоит остро — разработка и внедрение новых антибиотиков требуют много времени, а бактериофаги, применяемые для борьбы с патогенной бактерией, могут вызвать иммунный ответ у организма. По этой причине все чаще исследователи обращаются к инструментам генной инженерии. Потенциальная стратегия борьбы с устойчивыми штаммами — удаление генов вирулентности или устойчивости к антибиотикам, поскольку оно не оказывает сильного селективного давления на патогены. Технология CRISPR перспективна для подобных исследований, однако пока что отработана преимущественно на модельных микроорганизмах. Надежной системы доставки этой системы in vivo также пока недостает.

Одна из альтернатив — контроль экспрессии бактериальных генов на уровне транскрипции. У эукариот подобная регуляция экспрессии осуществляется, в частности, с помощью РНК-интерференции, в которой участвуют малые РНК. Однако они ранее не применялись для регуляции бактериальных генов из-за отсутствия у бактерий одного из ключевых компонентов РНК-интерференции — комплексов РНК-индуцированного сайленсинга (RISC). Методы доставки малых, или коротких интерферирующих РНК в клетки бактерий in vivo в настоящее время отсутствуют. Команда ученых из Китая предложила использовать для этого экзосомы, нагруженные малыми РНК.

Экзосомы служат для доставки микроРНК в клетки-мишени, например, через кровоток у млекопитающих. В них также упаковываются ключевые компоненты механизма РНК-интерференции — белки RISC, в том числе Argonaute2 (AGO2). Потенциал экзосом для доставки малых РНК в клетки бактерий проверяли на кишечной палочке (E. сoli). Она не только распространенный модельный объект — некоторые ее штаммы включены в список патогенов с лекарственной устойчивостью.

Экзосомы получали из клеток HEK293T. Их трансфицировали синтетической двухцепочечной РНК siAda, ведущая нить которой полностью комплементарна кодирующей области ada — этот ген кодирует компонент системы репарации ДНК. Секретируемые клетками экзосомы очищали и обрабатывали ими E. сoli. Клетки действительно поглощали малую интерферирующую РНК, причем процесс был наиболее эффективен в логарифмической фазе роста и зависел от дозы везикул. Возможность доставки малых РНК в клетки E. coli экзосомами человека подтвердилась и с другими клеточными линиями.

Для изучения распределения малых РНК внутри клетки авторы обработали бактерий экзосомами с флуоресцентно меченной siAda. Целевая РНК проникала внутрь бактериальной клетки, а не прикреплялась к мембране. Липидные компоненты экзосом при этом интегрировались с мембраной E. сoli.

Доставка siAda в клетки E. coli привела к снижению в них экспрессии метилтрансферазы Ada. Сама по себе siAda, доставленная методом электропорации, не влияла на уровень мРНК или белка мишени. Следовательно, снижение экспрессии Ada после обработки экзосомами не было результатом siAda-опосредованной регуляции через эндогенные пути клетки. С помощью иммунопреципитации авторы выяснили, что в экзосомах большая часть siAda была связана с белком AGO2. Эти комплексы хорошо сохранялись в процессе доставки экзосом и обнаруживались в лизате клеток E. coli. Однако экзосомы, полученные из клеток с нокаутом AGO2, не влияли на экспрессию Ada — это доказывает роль экзосомного комплекса AGO2-siAda участвует в сайленсинге генов E. coli.

Затем авторы провели эксперименты с метициллинрезистентным золотистым стафилококком (MRSA) — частой причиной инфекций с летальным исходом. Этот патоген содержит ген лекарственной устойчивости mecA, кодирующий пенициллин-связывающий белок 2a (PBP2a). Сайленсинг этого гена провели с помощью РНК siMecA, доставленной в экзосомах.

Исследователи предположили, что такой сайленсинг mecA снизит антибиотикорезистентность MRSA in vivo, тем самым повысив терапевтическую эффективность антибиотика метициллина. Для проверки этой гипотезы мышей инфицировали MRSA, а затем лечили в течение недели. Метициллин (3 мг/кг внутрибрюшинно) сам по себе не снижал смертность мышей, равно как и его комбинация с контрольными экзосомами, несущими случайную двуцепочечную РНК. А вот совместное введение метициллина и экзосом с siMecA защищало мышей от летальной инфекции — выживаемость составила 70%. Мыши оставались живы все 28 дней эксперимента. Серьезных побочных эффектов не отмечалось, целевая РНК накапливалась в органах и плазме крови через 24 часа после введения экзосом.

Для дальнейшей проверки функции экзосом in vivo из крови инфицированных и получающих лечение мышей выделяли клетки стафиллококка. В них детектировались как siMecA, так и белок AGO2, а экспрессия белка PBP2a была снижена. Следовательно, опосредованная экзосомами доставка siMecA и сайленсинг гена mecA действительно может повышать эффективность метициллина.

Затем исследователи создали генетическую схему, состоящую из двух функциональных модулей: промотора, который управляет транскрипцией siRNA, и кассеты экспрессии siRNA. Такой конструкцией трансфицировали клетки мышиной гепатомы (Hepa1-6), после чего собрали продуцируемые экзосомы. Такие siMecA-содержащие экзосомы доставляли целевую РНК в клетки стафилококка in vitro и подавляли в них экспрессию mecA. Их также удалось выработать в организме мышей, вводя в кровоток сами конструкты — полученный результат согласуется с данными о том, что печень может экспрессировать трансгены, введенные внутривенно.

Модульная генетическая схема для продукции siMecA-экзосом также повысила эффективность лечения инфекции. При заражении метициллинрезистентным стафилококком выжило 90% мышей, которым совместно вводили метициллин и систему экспрессии siMecA.

Таким образом, сайленсинг генов вирулентности или лекарственной устойчивости оказался рабочей стратегией борьбы с патогенами, и исследователи подчеркивают его перспективность.

Олигосахаридную вакцину против устойчивого к антибиотикам стафилококка испытали на животных