Система CRISPR/Cas13a детектирует рак по микроРНК в экзосомах

Экзосомы — мембранные везикулы, выделяемые клетками и содержащие множество различных молекул (белки, РНК, ДНК и так далее). Известно, что экзосомы также играют важную роль в прогрессии и метастазировании рака. Например, опухолевые клетки выделяют экзосомы во внешнюю среду, чтобы «подготовить почву» для образования вторичных очагов роста (метастазов). Кроме того, экзосомы способны регулировать транскрипционный профиль клеток, в которые они попадают, с помощью микроРНК. Таким образом, например, опухолевые клетки могут развивать резистентность к препаратам, получая экзосомы, способствующие устойчивости. Кроме того, некоторые молекулы, содержащиеся в экзосомах (в частности, микроРНК) являются уникальными для конкретных типов клеток. Именно поэтому в последнее время экзосомы привлекают много внимания как средства для диагностики онкологических заболеваний.

В настоящее время наиболее распространенным способом обнаружения экзосомальных микроРНК является количественная ПЦР, но такой подход подразумевает выделение и очистку РНК, что повышает риск контаминации. В новой статье ученые из Китая использовали липосомальные везикулы (по структуре почти идентичные экзосомам), несущие системы CRISPR/Cas13a и репортерные молекулы с флуорофорами. При добавлении таких липосом к экзосомам (при смешении раствора липосом с плазмой крови) происходило их слияние. Комплекс CRISPR/Cas13a связывается с экзосомальными микроРНК. При этом белок Cas13a активируется и расщепляет молекулу-репортер таким образом, что одна из его частей начинает испускать флуоресцентный сигнал, который затем можно измерить.

Для получения экзосом ученые использовали клеточную линию рака молочной железы MCF-7. Следующим шагом авторы проверили эффективность системы CRISPR/Cas13a для распознавания микроРНК. Основываясь на литературных данных, в качестве мишени была выбрана микроРНК-21 (MiR-21), роль которой была продемонстрирована во множестве болезней, в том числе — при раке молочной железы. Для того, чтобы определить специфичность используемого комплекса CRISPR/Cas13a, авторы провели флуоресцентный анализ с использованием репортера. Они показали, что флуоресцентный сигнал наблюдался лишь в том случае, когда в смеси находилась микроРНК-21, что демонстрировало селективность использованной системы.

Слияние липосом и экзосом подтвердили при помощи динамического лазерного светорассеяния, резонансного переноса энергии флуоресценции и конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Также авторы показали, что их система детектирует именно микроРНК внутри экзосом, а не свободные микроРНК плазмы. Для этого ученые измерили флуоресценцию свободной микроРНК-21 в трех разных концентрациях. Даже в самой высокой сигнал был существенно слабее, чем при детекции микроРНК-21 экзосом. Авторы предположили, что объяснением этому может послужить абсорбция свободных микроРНК на поверхности катионных липосом, что препятствует их проникновению внутрь частиц и, как следствие, активации системы CRISPR/Cas13a. Кроме того, статистический анализ пяти разных повторов эксперимента показал низкую вариабельность между разными повторами, что свидетельствовало о высокой воспроизводимости метода.

Чтобы оценить специфичность системы, авторы использовали экзосомы из нормальных клеток человеческого эпителия молочной железы MCF-10A как контроль — в таких клетках наблюдается низкая экспрессия микроРНК-21. Как и ожидалось, при сравнении контрольной линии MCF-10A и опухолевых MCF-7 и MDA-MB-231 система детектировала более высокий уровень сигнала в MCF-7 и MDA-MB-231.

Заключительным этапом исследования стала валидация эффективности системы на клинических образцах плазмы крови пациентов. Система продемонстрировала статистически значимую разницу в наличии экзосомальной микроРНК-21 между здоровыми донорами и пациентами с раком молочной железы.

МикроРНК miR-21 способствует метастазированию рака молочной железы