Система CRISPR-Csm снижает экспрессию эукариотических РНК на 90–99%

Возможность влиять на уровни РНК и белка в клетках и организме без воздействия на ДНК важна как для исследований, так и для терапии. Часто для этих целей используется РНК-интерференция. Однако этот метод может приводить к нецелевому разрезанию молекул с частичной комплементарностью, он неэффективен, если нужно таргетировать ядерные РНК. Его также нельзя применять в некоторых модельных системах, например, дрожжах. Есть необходимость в разработке новых инструментов для нокдауна РНК.

Возможной альтернативой РНК-интерференции могла бы стать система CRISPR. Однако самая популярная на настоящее время нуклеаза Cas13 деградирует также некомплементарные РНК в транс-положении. Дженнифер Дудна и соавторы предложили новый способ воздействия на уровень РНК с помощью CRISPR-системы типа III-A (CRISPR-Csm).

Комплекс Csm состоит из пяти субъединиц (Csm1–5), также дополнительный белок Cas6 необходим для процессирования прекурсора crРНК. Каждая субъединица обладает рибонуклеазной активностью, так что целевая РНК разрезается в нескольких местах. Csm1 также может разрезать одноцепочечные ДНК и действовать как синтаза циклических олигоаденилатов. Однако все три каталитические функции выполняют отдельные домены, так что при необходимости от них можно избавиться.

Исследователи выбрали Csm-комплекс типа III-A из Streptococcus thermophilus. Он хорошо охарактеризован, оптимально работает при 37 °C, может функционировать в эмбрионах рыбки данио и культуре человеческих клеток, а также имеет меньше компонентов, чем комплекс Cmr типа III-B.

Сначала авторы проверили, что все индивидуальные компоненты комплекса экспрессируются в клетках HEK293T. Они добавили к ним метку ядерной локализации, чтобы таргетировать ядерные РНК и пре-мРНК. Авторы подтвердили экспрессию и ядерную локализацию компонентов.

Чтобы протестировать систему, исследователи таргетировали eGFP в клеточной линии HEK293T, эксперссирующей этот белок. Для этого они котрансфицировали семь плазмид, кодирующих Csm1–5, Cas6 и crРНК. Эта стратегия не позволяет отбирать клетки, куда попали все компоненты, так что наблюдаемая эффективность нокдауна может быть ниже фактической. Интенсивность свечения снизилась на 25%. Авторы подтвердили, что наблюдаемый эффект объясняется именно активностью РНКаз. Они также оптимизировали параметры crРНК.

После этого исследователи упростили доставку системы, поместив все компоненты на один вектор. Это также позволило отобрать клетки, куда попала плазмида, и более точно подсчитать эффективность нокдауна, которая в этом эксперименте составила 50%.

Эффективность нокдауна проверили на эндогенных транскриптах. Для этого авторы выбрали панель из трех ядерных некодирующих РНК (XIST, MALAT1 и NEAT1) и восьми цитоплазматических мРНК (BRCA1, TARDBP, SMARCA1, CKB, ENO1, MECP2, UBE3A и SMAD4), которые экспрессируются на разных уровнях. Они достигли эффективности нокдауна более 90% для всех 11 РНК. Пик нокдауна достигался через 2–3 дня после трансфекции, после чего снижался.

Исследователи изучили нецелевую активность системы. Для Csm-комплекса был показан очень низкий уровень нецелевогого нокдауна, в отличие от системы CRISPR-Cas13 и РНК-интерференции. Также система CRISPR-Cas13 значительно снижала пролиферацию и жизнеспособность клеток, тогда как Csm-комплекс и РНК-интерференция на них не влияли. Кроме того, Csm с флуоресцентной меткой можно использовать для визуализации РНК в живых клетках.

Таким образом, Csm-комплекс — это мощный инструмент для нокдауна эукариотических РНК. Он обладает высокой эффективностью (90–99%) и специфичностью (в десять раз меньше нецелевых воздействий, чем Cas13). Более того, комплекс не оказывает цитотоксического эффекта.

CRISPR-система активирует экспрессию молчащих генов у Streptomyces