Системы для редактирования РНК на основе сверхмалых белков Cas13bt помещаются в AAV-вектор

Ученые из США идентифицировали новую подгруппу сверхмалых белков Cas13 — Cas13bt и разработали на их основе две системы для таргетного редактирования РНК в клетках млекопитающих. Новые системы могут быть доставлены в клетки с помощью аденоассоциированного вектора.

Модель молекулы инозина.

Credit: molekuul | 123rf.com

Системы CRISPR-Cas13 используются для направленного редактирования РНК, которое обеспечивает нокдаун гена-мишени. Программируемое редактирование РНК имеет высокий терапевтический потенциал, поскольку с его помощью в клетки организма вносятся временные, ненаследуемые изменения. В частности, в клетках млекопитающих хорошо работает белок Cas13b. Однако существующие на данный момент системы CRISPR-Cas13 нельзя доставить в клетку в терапевтических целях, поскольку они слишком велики, чтобы поместиться в аденоассоциированный вирус — наиболее популярный вектор в генной терапии.

Команда Фэна Чжана (Институт Бродов) при участии Евгения Кунина и Киры Макаровой (Национальные институты здравоохранения, США) открыла новую подгруппу белков Cas13b, названную Cas13bt. Белки Cas13bt примечательны своим сверхмалым размером: самый маленький представитель семейства состоит всего лишь из 408 аминокислотных остатков против 1 224 остатков у белка Cas13b. В отличие от других белков группы Cas13b, в локусе, кодирующем Cas13bt, отсутствуют гены вспомогательных белков. Как и другие члены группы Cas13b, Cas13bt, несмотря на свой сверхмалый размер, активны в клетках млекопитающих и подходят для программируемого редактирования РНК.

На первом этапе авторы работы показали возможность направленного нокдауна с помощью Cas13bt в клетках Escherichia coli, а затем подтвердили активность Cas13bt в клетках человека на примере культуры клеток HEK293FT. В качестве мишеней для Cas13bt ученые выбрали мРНК, кодирующую люциферазу Gluc. Они проверили эффективность работы двух белков семейства Cas13bt, Cas13bt1 и Cas13bt3, и показали, что оба белка обеспечивают программируемый нокдаун клетки-мишени.

Чтобы белки Cas13bt можно было использовать для редактирования РНК, исследователи «сшили» каталитически неактивные формы Cas13bt1 и Cas13bt3 с гиперактивным мутантом РНК-аденозиндезаминазы ADAR2. Полученные системы редактирования РНК были названы REPAIR.t1 и REPAIR.t3 соответственно. Эффективность их работы в клетках млекопитающих подтвердили на мРНК люциферазы Cluc. Системы успешно «исправляли» мутацию W85X в люциферазе, заменяя аденозин на инозин. Авторы показали, что REPAIR.t1 и REPAIR.t3 работают наиболее эффективно, если аденозин, который не образует комплементарной пары с соответствующим нуклеотидом в гидовой РНК, находится в пределах первых 18–22 нуклеотидов на 5’-конце сайта-мишени. Ученые также создали системы для программируемого дезаминирования цитидина на основе Cas13bt1 и Cas13bt3 — RESCUE.t1 и RESCUE.t3. В этом случае к белкам Cas13bt «пришивали» белок ADAR2dd.

Наконец, на примере REPAIR.t1 ученые показали, что компоненты системы — последовательность, кодирующая сшитый с ADAR2 белок Cas13bt1, а также кассета для экспрессии направляющей РНК — могут быть успешно помещены в аденоассоциированный вектор и доставлены в клетки HEK293FT.

Другая команда из США сообщила на прошлой неделе о миниатюрной CRISPR-системе CasMINI, основанной на белке Cas12f. Система нацелена на ДНК и позволяет редактировать геном и регулировать экспрессию в клетках млекопитающих.

Источник

Kannan, S., Altae-Tran, H., Jin, X. et al. Compact RNA editors with small Cas13 proteins. // Nature Biotechnology, published 30 August 2021, DOI: 10.1038/s41587-021-01030-2

Добавить в избранное

Вам будет интересно