Восстановление нормального сплайсинга STMN2 может стать стратегией терапии при нейродегенерациях

TDP-43 — это РНК-связывающий белок, ассоциированный с протеинопатиями, которые развиваются при его агрегации и потере ядерной локализации. TDP-43-протеинопатии наблюдаются при боковом амиотрофическом склерозе (БАС), лобно-височной деменции, и других нейродегенеративных заболеваниях. Кроме того, недавно было выделено новое заболевание — лимбическая возраст-ассоциированная TDP-43-патия (LATE). По симптомам она напоминает болезнь Альцгеймера, но в мозге пациентов накапливается TDP-43, а не бета-амилоид.

Ранее было показано, что TDP-43 регулирует созревание пре-мРНК белка статмина-2 (STMN2). Этот белок обильно экспрессируется в нейронах; он необходим для роста аксонов при развитии мозга. Авторы новой статьи, опубликованной в Science, описали механизм, за счет которого TDP-43 регулирует процессинг пре-мРНК STMN2.

TDP-43 связывается с пре-мРНК STMN2 в экзоне 2a; область связывания содержит специфическую последовательность — три прилежащих друг к другу гексамера GUGUGU и располагается между криптическим сайтом сплайсинга и сайтом полиаденилирования. В экспериментах на клетках ученые с помощью системы CRISPR-Cas9 заменили GU-мотив на 19-нуклеотидную аптамерную последовательность бактериофага MS2. Соответствующий участок РНК формирует шпильку.

В человеческих нейронах линии SH-SY5Y такая модификация вызвала снижение концентрации полноразмерной мРНК STMN2 вдвое. Кроме того, повышалось концентрация укороченной версии мРНК, которая продуцировалась за счет криптического сайта сплайсинга и сайта полиаденилирования. Ученые сделали вывод, что связывание TDP-43 необходимо для подавления криптического сайта сплайсинга. Дальнейшие эксперименты показали, что блокирование сплайсинга и полиаденилирования происходит за счет стерических затруднений, возникающих при прямом взаимодействии TDP-43 c GU-мотивом.

Затем исследователи установили, что нарушение процессинга пре-мРНК STMN2 при снижении концентрации TDP-43 вызваны именно криптическим сплайсингом, а не полиаденилированием. Это выяснилось после удаления из генома нейронов по отдельности мотива полиаденилирования и акцепторного сайта сплайсинга на 3'-конце.

В норме мышиный гомолог Stmn2 не подвергается криптическому сплайсингу. В опыте с нейроноподобными мышиными клетками перенос сегмента человеческого STMN2, содержащего экзон 2a, в мышиный гомолог индуцировал криптические сплайсинг и полиаденилирование.

На следующем этапе авторы успешно предотвратили патологический процессинг пре-мРНК STMN2 в культуре нейронов с частичной потерей функции TDP-43. Они использовали CRISPR-эффектор CasRx, который специфически связывает РНК, не расщепляя ее, но за счет стерических взаимодействий локально предотвращает процессинг. В результате концентрация полноразмерной мРНК STMN2 возросла на 40%. Подобный эффект ученые получили и с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (ASO), нацеленных на криптические сайты сплайсинга и полиаденилирования. В культуре нейронов с мутантным TDP-43 антисмысловые олигонуклеотиды привели концентрацию STMN2 к значениям, близким норме. Технология ASO считается перспективной для таргетной терапии различных нейродегенераций.

Наконец, ученые показали, что восстановление нормального сплайсинга STMN2 с помощью ASO возвращает моторным нейронам с дефицитом TDP-43 способность к регенерации аксонов. Это подтвердилось в экспериментах in vitro и на мышах с гуманизированным геном Stmn2.

По мнению авторов, исследование дает основания для клинических испытаний ASO на пациентах с БАС и другими заболеваниями, которые сопровождаются TDP-43-протеинопатией.

Развитие бокового амиотрофического склероза связано с нарушением сплайсинга