Взаимодействие подопланина с рецептором тромбоцитов приводит к повреждению клеток почек
Ученые из Японии и США предположили, что расположенный на тромбоцитах рецептор CLEC-2 может взаимодействовать с гликопротеином PDPN на поверхности подоцитов почек и вызывать изменения в этих клетках. Опыты in vitro и in vivo подтвердили изменение морфологии и свойств подоцитов под влиянием CLEC-2, а также показали, что PDPN на подоцитах может выступать в качестве сенсора утечки тромбоцитов.

Подопланин (PDPN) — это мембранный О-гликозилированный гликопротеин типа муцинов. PDPN экспрессируется на поверхности разных типов клеток, включая подоциты почек (задействованы в первой стадии формирования мочи), альвеолярные эпителиальные клетки, лимфатические эндотелиальные клетки, стромальные фибробластические ретикулярные клетки лимфоузлов и клетки опухолей. На подоцитах PDPN экспрессируется наиболее интенсивно, а его экспрессия эволюционно консервативна. PDPN является эндогенным лигандом лектиноподобного рецептора типа С-2 (CLEC-2) на тромбоцитах, за счет чего участвует в индуцированной опухолевыми клетками агрегации тромбоцитов и других процессах в организме. Взаимодействие между CLEC-2 и PDPN активирует двунаправленную передачу сигналов. С одной стороны, PDPN выступает в качестве лиганда, как это было описано выше. С другой стороны, связывание PDPN c CLEC-2 оказывает влияние на клетки, экспрессирующие подопланин.
Роль PDPN в подоцитах не до конца ясна. Снижение экспрессии PDPN подоцитами связывают с процессом сглаживания ножек этих клеток, протеинурией и снижением селективной гломерулярной проницаемости. Цитоплазматический хвост PDPN взаимодействует с белками эзрином (цитовиллином), радиксином и моезином (вместе обозначаются как ERM), которые связываются с актиновым цитоскелетом и регулируют форму клеток. Исследования показывают, что, хотя у мышей с нарушением экспрессии гена Pdpn не обнаруживается абнормальный почечный фенотип, подавление PDPN с помощью siRNA в культивированных подоцитах меняет их клеточную форму с вытянутой на круглую вместе с изменением распределения эзрина в клетках.
В норме подоциты отграничены от тромбоцитов, но при нарушении гломерулярного барьера они могут взаимодействовать с CLEC-2 на тромбоцитах. К тому же растворимая форма CLEC-2 содержится в плазме человека. Исследователи из Японии и США предположили, что CLEC-2 может каким-то образом влиять на подоциты с помощью гликопротеина PDPN. В новой работе они проверили эффекты CLEC-2 на подоциты in vitro и in vivo.
Вначале ученые выяснили эффекты рекомбинантного человеческого Fc-CLEC-2 на культивированные мышиные подоциты. Эксперименты по преципитации (pull-down essay) показали, что Fc-CLEC-2 успешно связывается с мышиными PDPN. Подоциты, обработанные Fc-CLEC-2, в сравнении с контролем приобретали округлую клеточную форму без острых выступов и имели низкие уровни F-актина. Более того, в течение одного часа у них снижалась адгезия к коллагену (а именно к пластинам, покрытым коллагеном). Также они легче мигрировали, чем контрольные клетки.
Чтобы определить, как CLEC-2 индуцирует внутриклеточную передачу, авторы изучили статус фосфорилирования белков ERM. Вестерн-блот показал, что обработка Fc-CLEC-2 снижала соотношение фосфорилированных ERM к нефосфорилированным (pERM/ERM) в культивированных подоцитах, указывая на то, что CLEC-2 стимулирует дефосфорилирование ERM. С помощью вестерн-блота и количественной ПЦР было обнаружено, что синтез эзрина подавлялся в подоцитах in vitro.
Для того, чтобы протестировать влияние CLEC-2 на подоциты in vivo, исследователи получили новый рекомбинантный CLEC-2 белок меньших размеров (FLAG-CLEC-2). Они вводили его мышам и через час изучали их почки. Двойное иммуноокрашивание подтвердило связывание FLAG-CLEC-2 с подоцитами. Однако в изолированных через час после инъекции гломерулах при использовании методики вестрен-блот не было обнаружено FLAG, что указывало на отсутствие интернализации (включения) FLAG в подоциты. Инкубирование клеток с FLAG-CLEC-2 при разных температурах подтвердило, что рекомбинантный белок не включается в подоциты.
Количественная ПЦР с обратной транскрипцией показала, что инфузия FLAG-CLEC-2 увеличивала концентрацию мРНК-маркера повреждения подоцитов Serpine1 в гломерулах. Результаты вестерн-блота гломерулярного лизата свидетельствовали о том, что FLAG-CLEC-2 снижал соотношение pERM/ERM, что также подтверждалось при двойном иммуноокрашивании на pERM и подокаликсин. С помощью электронной микроскопии были выявлены расширения отростков ножек подоцитов, что указывает на изменения цитоскелета под воздействием CLEC-2.
Ученые предположили, что подоциты могут контактировать с тромбоцитами при повреждении гломерул. Для проверки этого утверждения они смоделировали повреждение подоцитов у мышей линии NEP25 посредством инъекции иммунотоксина LMB2. Спустя пять дней после инъекции у мышей в моче появились белок и кровь, а ИГХ-анализ показал, что в осадке мочи содержались CD41+ тромбоциты. Для подтверждения тромбоциты были отобраны у мышей дикого типа, помечены с помощью красителя DiI и введены мышам NEP25 через пять дней после инъекции LMB2. Меченые тромбоциты были обнаружены в моче у этих мышей.
Результаты исследования свидетельствуют о том, что PDPN на подоцитах могут выступать в качестве сенсоров утечки тромбоцитов. Учитывая, что PDPN на подоцитах и CLEC-2 на тромбоцитах эволюционно консервативны, такой механизм распознавания утечки тромбоцитов может быть полезен, например, для ускорения процессов заживления. Однако необходимы дальнейшие исследования для подтверждения характера влияния PDPN на подоциты.
Источник:
Tanaka K., et al. C-type lectin-like receptor (CLEC)-2, the ligand of podoplanin, induces morphological changes in podocytes. // Scientific Reports 12, 22356 (2022), published on 26 December 2022. DOI: 10.1038/s41598-022-26456-9