Взаимодействие подопланина с рецептором тромбоцитов приводит к повреждению клеток почек

Подопланин (PDPN) — это мембранный О-гликозилированный гликопротеин типа муцинов. PDPN экспрессируется на поверхности разных типов клеток, включая подоциты почек (задействованы в первой стадии формирования мочи), альвеолярные эпителиальные клетки, лимфатические эндотелиальные клетки, стромальные фибробластические ретикулярные клетки лимфоузлов и клетки опухолей. На подоцитах PDPN экспрессируется наиболее интенсивно, а его экспрессия эволюционно консервативна. PDPN является эндогенным лигандом лектиноподобного рецептора типа С-2 (CLEC-2) на тромбоцитах, за счет чего участвует в индуцированной опухолевыми клетками агрегации тромбоцитов и других процессах в организме. Взаимодействие между CLEC-2 и PDPN активирует двунаправленную передачу сигналов. С одной стороны, PDPN выступает в качестве лиганда, как это было описано выше. С другой стороны, связывание PDPN c CLEC-2 оказывает влияние на клетки, экспрессирующие подопланин.

Роль PDPN в подоцитах не до конца ясна. Снижение экспрессии PDPN подоцитами связывают с процессом сглаживания ножек этих клеток, протеинурией и снижением селективной гломерулярной проницаемости. Цитоплазматический хвост PDPN взаимодействует с белками эзрином (цитовиллином), радиксином и моезином (вместе обозначаются как ERM), которые связываются с актиновым цитоскелетом и регулируют форму клеток. Исследования показывают, что, хотя у мышей с нарушением экспрессии гена Pdpn не обнаруживается абнормальный почечный фенотип, подавление PDPN с помощью siRNA в культивированных подоцитах меняет их клеточную форму с вытянутой на круглую вместе с изменением распределения эзрина в клетках.

В норме подоциты отграничены от тромбоцитов, но при нарушении гломерулярного барьера они могут взаимодействовать с CLEC-2 на тромбоцитах. К тому же растворимая форма CLEC-2 содержится в плазме человека. Исследователи из Японии и США предположили, что CLEC-2 может каким-то образом влиять на подоциты с помощью гликопротеина PDPN. В новой работе они проверили эффекты CLEC-2 на подоциты in vitro и in vivo.

Вначале ученые выяснили эффекты рекомбинантного человеческого Fc-CLEC-2 на культивированные мышиные подоциты. Эксперименты по преципитации (pull-down essay) показали, что Fc-CLEC-2 успешно связывается с мышиными PDPN. Подоциты, обработанные Fc-CLEC-2, в сравнении с контролем приобретали округлую клеточную форму без острых выступов и имели низкие уровни F-актина. Более того, в течение одного часа у них снижалась адгезия к коллагену (а именно к пластинам, покрытым коллагеном). Также они легче мигрировали, чем контрольные клетки.

Чтобы определить, как CLEC-2 индуцирует внутриклеточную передачу, авторы изучили статус фосфорилирования белков ERM. Вестерн-блот показал, что обработка Fc-CLEC-2 снижала соотношение фосфорилированных ERM к нефосфорилированным (pERM/ERM) в культивированных подоцитах, указывая на то, что CLEC-2 стимулирует дефосфорилирование ERM. С помощью вестерн-блота и количественной ПЦР было обнаружено, что синтез эзрина подавлялся в подоцитах in vitro.

Для того, чтобы протестировать влияние CLEC-2 на подоциты in vivo, исследователи получили новый рекомбинантный CLEC-2 белок меньших размеров (FLAG-CLEC-2). Они вводили его мышам и через час изучали их почки. Двойное иммуноокрашивание подтвердило связывание FLAG-CLEC-2 с подоцитами. Однако в изолированных через час после инъекции гломерулах при использовании методики вестрен-блот не было обнаружено FLAG, что указывало на отсутствие интернализации (включения) FLAG в подоциты. Инкубирование клеток с FLAG-CLEC-2 при разных температурах подтвердило, что рекомбинантный белок не включается в подоциты. 

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией показала, что инфузия FLAG-CLEC-2 увеличивала концентрацию мРНК-маркера повреждения подоцитов Serpine1 в гломерулах. Результаты вестерн-блота гломерулярного лизата свидетельствовали о том, что FLAG-CLEC-2 снижал соотношение pERM/ERM, что также подтверждалось при двойном иммуноокрашивании на pERM и подокаликсин. С помощью электронной микроскопии были выявлены расширения отростков ножек подоцитов, что указывает на изменения цитоскелета под воздействием CLEC-2.

Ученые предположили, что подоциты могут контактировать с тромбоцитами при повреждении гломерул. Для проверки этого утверждения они смоделировали повреждение подоцитов у мышей линии NEP25 посредством инъекции иммунотоксина LMB2. Спустя пять дней после инъекции у мышей в моче появились белок и кровь, а ИГХ-анализ показал, что в осадке мочи содержались CD41+ тромбоциты. Для подтверждения тромбоциты были отобраны у мышей дикого типа, помечены с помощью красителя DiI и введены мышам NEP25 через пять дней после инъекции LMB2. Меченые тромбоциты были обнаружены в моче у этих мышей.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что PDPN на подоцитах могут выступать в качестве сенсоров утечки тромбоцитов. Учитывая, что PDPN на подоцитах и CLEC-2 на тромбоцитах эволюционно консервативны, такой механизм распознавания утечки тромбоцитов может быть полезен, например, для ускорения процессов заживления. Однако необходимы дальнейшие исследования для подтверждения характера влияния PDPN на подоциты.

Коронавирус поражает клетки почечного тельца