CRISPR на биочипах. Интервью с Дмитрием Грядуновым

Система CRISPR-Cas — не только инструмент редактирования генома. Д.б.н. Дмитрий Грядунов, зав. Лабораторией технологий молекулярной диагностики (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) рассказал на конференции в «Сириусе» (Сочи) о применении CRISPR в диагностике. В 2018 году ученые из Массачусетского технологического института и Гарвардского университета предложили технологию для детекции определенных последовательностей нуклеиновых кислот, получившую название SHERLOCK. Принцип метода следующий: в присутствии фрагмента, совпадающего с гид-РНК, Cas-нуклеаза расщепляет не только его, но и другие молекулы, с флуоресцирующей группой на одном конце и тушителем (квенчером) на другом; концы разрезанной молекулы удаляются друг от друга, и флуоресценция сообщает о присутствии искомой последовательности. Метод позволяет обнаружить вирус в образце, мутацию в геноме человека или бактерии, генетическую модификацию сельскохозяйственного растения и т.п. Тут возможны разные технические решения — можно, например, адаптировать под CRISPR-Cas известную отечественную технологию и создать биосенсоры для выявления лекарственно устойчивых микроорганизмов.

Технология гидрогелевых биочипов, предмет гордости Института молекулярной биологии, — трехмерные биочипы с каплями геля полусферической формы, содержащими биомолекулы. Только что, в декабрьском номере журнала Acta Naturae, вышел наш обзор по ним. Эти микрочипы давно вышли в практику, они применяются более 15 лет в различных направлениях — и в онкологии, и в лечении и диагностике лекарственно-устойчивых форм туберкулеза. И как один из тех, кто развивал технологию гидрогелевых биочипов, я считаю, что в отношении ДНК-биочипов мы достигли технологического предела. Особенно это заметно на фоне развивающихся технологий полногеномного секвенирования — его пока нельзя назвать рутинным методом диагностики, это скорее мощнейший инструмент в научных исследованиях, но, тем не менее, за ним будущее.

Почему нас заинтересовала нуклеазная система детекции? Во-первых, потому что в публикациях заявлена чрезвычайно высокая чувствительность — чуть ли не аттомоли нуклеиновых кислот, буквально единичные копии молекул. Во-вторых, как мы полагаем, это решит известную проблему мультиплексного анализа, особенно анализа ДНК: чем больше емкость системы, тем ниже чувствительность и тем хуже работать с клиническим материалом.

Для мультиплексности, распознавания разных мишеней в образце, понадобятся несколько Cas-нуклеаз с разными гид-РНК? И будут ли они работать в геле?

В этом нет проблемы. Наша технология биочипов позволяет работать не только с ДНК, но и с белками. Что важно, все ферменты сохраняют активность в гидрогеле, и в случае ПЦР-амплификации, и в случае ЛЦР, лигазной детектирующей реакции, и, например, при взаимодействии барназа-барстар. Мы можем подбирать условия в гидрогеле так, что в каждый его элемент будет помещен весь молекулярный комплекс, каждый со своей направляющей РНК. Первичные эксперименты показывают, что такая система в геле за счет стерических препятствий — чего нет в растворах — достаточно специфично детектирует и расщепляет молекулы-мишени. Как пишут сами создатели SHERLOCK, в растворе специфичность существенно меньше, нуклеаза может активироваться и без распознавания дуплекса. Но, безусловно, это только первичные эксперименты, подбор условий очень важен. Скорее всего, нам надо будет искать свои ферменты. Семейство белков Cas колоссальное, их уже сотни, и, конечно, подбор нуклеазы под отечественную технологию будет одной из ключевых составляющих работы. У нас есть микробиологи, которые умеют решать такие задачи. Здесь есть чем позаниматься. Самое главное, я считаю, — это может быть шагом от чипов как лабораторного инструмента, приложения к ПЦР-диагностике, в сторону систем lab-on-a-chip, полевой диагностики.

Как это будет устроено? Чип, на нем капельки гидрогеля, а в них нуклеаза, направляющая РНК…

…И детектирующий зонд с тушителем и красителем. По сути дела, мы в нашу технологию, которая давно отработана, — чипы изготавливаются сотнями и тысячами в неделю, — в эту же самую платформу просто добавим новый элемент. Подбираем условия, подбираем нуклеазу и проводим совместную полимеризацию-иммобилизацию геномного редактора — Cas-нуклеазы и РНК-зондов.

Но еще нужно считывающее устройство для детекции флуоресценции?

Считывающее устройство мы разработали больше десяти лет назад, оно зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения, как медицинское изделие для диагностики in vitro. И здесь система детекции останется такой же, что, собственно, и определяет преимущества: есть готовая отечественная платформа. Возможно, удастся уйти от амплификации нуклеиновых кислот исходного образца.

Эти устройства уже есть во многих лабораториях?

У всех, кто так или иначе применяет чипы для медицинской диагностики, — это порядка сотни на РФ, Казахстан, Кыргызстан, Беларусь и ряд других стран СНГ. Есть они и кое-где за рубежом, например, во Франции, в Тулузе делают генотипирование вирусов гепатита С.

Кто будет заниматься именно CRISPR-диагностикой на базе микрочипов?

Этим будут заниматься моя лаборатория, лаборатория биологических микрочипов, возможно, ряд других подразделений, например, лаборатория регуляции внутриклеточного протеолиза, где есть специалисты, которые будут осуществлять подбор нуклеаз. Работать будем в тесном контакте с медицинскими организациями различного профиля, в зависимости от задачи.

А что с патентованием?

Я думаю, что мы будем патентовать сначала в России, а затем искать средства на зарубежное патентование. У нас большой опыт в этой сфере. Так сложилось исторически, что технология гидрогелевых биочипов, которая была развита еще Андреем Дарьевичем Мирзабековым, сразу была востребована и коммерциализирована, уже в 90-е годы. А дальше, во-первых, у нас есть опыт успешного взаимодействия по патентам с французской компанией Argene Biosoft, ныне входящей в транснациональную корпорацию bioMerieux. И параллельно — наша дочерняя компания ООО «БИОЧИП-ИМБ», которая работает в институте с 2009 года, в своем уставном капитале также имеет комплект патентов, покрывающих приложения технологии биочипов. Можно сказать, что это пример успешного трансфера интеллектуальной собственности института из академической среды в бизнес-страту.

Почему в качестве цели вы выбрали антибиотикорезистентность?

Во-первых, это та задача, которой я давно занимаюсь: исследование механизмов формирования антибиотикорезистентности патогенных микроорганизмов, поиск генетических детерминант устойчивости к новым препаратам. У нас есть уже есть и чипы, и полногеномное секвенирование, и весь возможный спектр фенотипических методов для детекции антибиотикорезистентности; новая технология сюда органично впишется. Во-вторых, потому что это одна из глобальных задач — в Программе развития генетических технологий есть направление «Биобезопасность», и мы решили, что антибиотикорезистентность пойдет именно туда. В-третьих, эта задача прописана в одном из ключевых приоритетов Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации.

Понадобится постоянное пополнение базы последовательностей, связанных с устойчивостью?

Да. Но для медицинской диагностики очень важно выбрать спектр наиболее актуальных эндемичных вариантов патогенов: для РФ он один, для Китая другой, для Африки третий. Это относится к целому ряду возбудителей: туберкулез, гонорея, вирусные возбудители, и, в общем-то, мы их знаем. Одна из последних задач, которая была решена в прошлом году, — мы нашли, что возбудитель туберкулеза в течение двух-трех месяцев приобретает устойчивость к препаратам нового поколения — самым новым, таким как бедаквилин и линезолид, которые действуют на мишени, ранее не задействованные классическими препаратами. Тем не менее для РФ такой спектр детерминант и, соответственно, механизм был открыт, это опубликовано в Journal of Antimicrobial Chemotherapy, и мы, возможно, в эту сторону будем двигаться. Но все-таки, говоря о диагностике, — здесь мы хорошо представляем себе именно тот спектр генетических маркеров, который покроет с высокой чувствительностью и специфичностью необходимый диагностический тест.

А нет ли у вас в плане обычных респираторных инфекций? Таких тест-систем, чтобы быстро отличать вирус гриппа от других вирусов или вирусную инфекцию от бактериальной?

Это немного другая задача. У нас сейчас выходит обзор по биомаркерам, и я считаю, что у этого направления тоже есть будущее — если смотреть не просто ДНК патогенов верхнего и нижнего респираторного тракта, но и спектр биомаркеров в сыворотке крови. Можно подобрать такие комбинации, мы их называем сигнатурами, — маркеры воспаления, интерлейкины, другие сигнальные молекулы и т.д., — которые для каждой инфекции дадут специфическую картину. Эти сигнатуры на хороших выборках позволят различить, бактериальная у вас инфекция, вирусная, смешанная или вторичная — то есть сначала вирусная, затем бактериальная. Весной должна выйти наша статья по этой тематике. Чем больше этим занимаешься, тем лучше понимаешь, что не только ДНК-диагностика, но и вот такой мультиплексный иммуноанализ на биочипах и на системах Люминекс — вполне современный метод молекулярной диагностики со своими преимуществами.