Дэррил Ирвин: «Мы благодарны пользователям из России, они дают нам много статей»

Неинвазивный пренатальный скрининг (НИПС) включен в рекомендации по ведению беременности крупными профессиональными сообществами, такими как Российское Общество Акушеров Гинекологов, American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG), American College of Medical Genetics (ACMG). НИПС предназначен для выявления наиболее часто встречающихся анеуплоидий: трисомия по хромосоме 21 (синдром Дауна), трисомия по хромосоме 18 (синдром Эдвардса) и трисомия по хромосоме 13 (синдром Патау).

НИПС основан на изучении фетальной внеклеточной ДНК, циркулирующей в крови матери. Компания Agena Bioscience разработала технологию для анализа ДНК плода на анеуплоидии с помощью MALDI-TOF (времяпролетная матрично-активированная лазерная десорбционная ионизация). Тест «NIPT T13/T18/T21» проводится на платформе MassARRAY® и предназначен для определения риска трисомий по хромосомам 13, 18 и 21 начиная с 10 недели беременности.

Материнская ДНК в пробе отделяется от фетальной энзиматически, с помощью метилчувствительной рестрикции. Сама же методика определения анеуплоидий заключается в анализе соотношения аллелей с использованием внутреннего контроля — дополнительного реагента с известной последовательностью нуклеотидов и, соответственно, известной массой. В результате сравнения количества ионов гена-мишени и ионов контроля получаются следующие соотношения: 1:1 при нормальном наборе хромосом и 2:1 или 1:2 при трисомии. Анализ с помощью MALDI-TOF имеет высокую точность и не требует флуоресцентных или иных маркеров. Программное обеспечение для обработки результатов интегрировано в систему MassARRAY®, благодаря этому результаты формируются автоматически уже на следующий день.

Вице-президент Agena Bioscience Дэррил Ирвин рассказал корреспонденту PCR.news о применениях технологии MassARRAY® и о преимуществах неинвазивных пренатальных тестов, основанных на этой технологии.

Итак, давайте начнем. Сегодня я с большим удовольствием побеседую с доктором Даррилом Ирвином, вице-президентом по научным вопросам компании Agena Bioscience. Мы поговорим о технологиях Agena и об их применении. Насколько я понимаю, Agena использует технологию MassARRAY®, это их главная технология. Она позволяет анализировать SNP в ДНК с помощью масс-спектрометрии. Эта технология существует уже довольно продолжительное время, около 20 лет. Вероятно, в последнее время она находится несколько в тени NGS, но сейчас она возвращается в нишу экономичных низко- и среднепроизводительных систем скрининга.

Да, в широком смысле вы правы. Технология Agena называется MassARRAY®, она основана на применении масс-спектрометрии MALDI-TOF для анализа нуклеиновых кислот. Мы анализируем ряд различных типов нуклеиновых кислот и изменений в них, включая SNP, наследуемые в половых клетках или соматические в клетках рака. Также мы смотрим слияния генов, которые могут происходить в соматических клетках, маркеры, экспрессию определенных генов и многое другое. Технология позволяет изучать любые нуклеиновые кислоты, поскольку масс-спектрометрия просто детектирует и вычисляет массу фрагмента нуклеиновой кислоты, и, зная массу, вы можете узнать последовательность. Большинство технологий секвенирования используют флуоресценцию: используются праймеры с флуоресцентными метками и заключение делается на основе их связывания с матрицей, а в случае масс-спектрометрии мы не используем флуоресцентные метки, а детектируем нуклеиновую кислоту напрямую и определяем ее массу. Технология существует около 20 лет, а Agena была основана 7 лет назад. Мы улучшили технологию, в частности, сам технологический процесс: автоматизировали подготовку образцов и анализ результатов. Также мы поспособствовали эволюции этой технологии. Так как многие болезни требуют определения большого количества биомаркеров у пациента, необходимо проводить анализ биомаркеров с мультиплексностью среднего уровня, чтобы определить возможный ход лечения. С масс-спектрометрией такие анализы можно проводить очень качественно и масштабировать их с 2–3 биомаркеров до 40–50. Это и есть та эволюция, которую мы наблюдаем в последние 15 лет.

А что насчет образцов? Есть ли какие-то ограничения на анализируемый материал?

Мы анализируем быстро деградирующие образцы, и если ДНК разложилась, результаты уже не надежны. Это так и в случае c образцами, зафиксированными формалином и заключенными в парафин, и с внеклеточной ДНК. Наш метод достаточно надежен для различных типов нуклеиновых кислот, присутствующих в малом количестве копий. Мы можем амплифицировать ДНК даже с единичной клетки. Но всегда нужно задавать себе вопрос: сколько ДНК нужно для конкретного исследования? Если вы пытаетесь детектировать соматическую мутацию, ее частота может быть около 1%, и вы не можете анализировать только две молекулы ДНК, потому что с двух копий детектируются только мутации с 50% частотой. Чтобы достичь необходимого вам уровня чувствительности, стоит вначале математически посчитать, сколько ДНК надо внести в анализ.

Если вы можете измерить 50 маркеров в пределах одной клетки, то, например, можете оценивать временную динамику клеток в опухоли пациента. Есть ли у вас подобные разработки?

Да, мы сотрудничаем с несколькими группами, занимающимися единичными клетками. Недавно у нас была работа на единичных сперматозоидах, которые несут всего по одной копии ДНК — это минимально возможное количество вносимой в анализ ДНК. Да, у нас есть методики, где мы можем брать единичные клетки, амплифицировать с них ДНК и смотреть маркеры в них.

Насколько такие подходы можно кастомизировать? Насколько я понимаю, в ваших наборах содержатся уже готовые, разработанные компанией панели биомаркеров, но вы также говорите, что заказчик может сделать свою собственную панель. Как это работает? Могу ли я сделать свою панель в своей лаборатории, или мне нужно заказывать ее у вас?

У нас есть три опции кастомизации. Во-первых, у нас огромное разнообразие уже готовых панелей, их состав подходит для большинства стандартных задач, обычно оно соответствует клиническим рекомендациям. Если эти панели не подходят под вашу задачу, у нас есть специальная научная группа, в которой работают 16 ученых с большим опытом разработки кастомных наборов. Они разработают панель специально для вас, проверят его на вашем биоматериале и вышлют вам надежную рабочую панель. Третья опция — у нас есть возможность дизайна набора самим покупателем, он получает доступ к программному обеспечению для кастомного дизайна, куда загружает свои последовательности и создает свою панель, сам заказывает свои олигонуклеотиды. Большинство групп предпочитает отдавать задачу дизайна нам, поскольку мы специалисты в этом. Дизайн у нас занимает 4–10 недель в зависимости от сложности панели.

Были ли какие-то сложные случаи, когда у вас не получилось создать зонды? Например, какие-то SNP лежат в регионах с большим числом повторов.

Да, конечно, в геноме человека есть «тяжелые» регионы. В нашем подходе два этапа, которые позволяют увеличить специфичность: это ПЦР-амплификация с последующим однонуклеотидным удлинением. Мы используем ПЦР с детекцией по конечной точке, которая даже в конечной точке еще является количественной благодаря нашей технологии и при этом позволяет реакции пройти полностью. Поэтому у нас очень высокий выход от материала, предоставленного заказчиком, до надежного набора для анализа. У нас этот выход наиболее высокий среди всех технологий, присутствующих на рынке. Да, всегда есть сложные регионы генома, и опыт позволяет нам преодолеть эти трудности. Но в очень редких случаях мы не сможем сделать зонды на эти области. Обычно неудачу можно предсказать заранее, еще до запуска изготовления набора. Наше программное обеспечение выдаст предупреждение, и мы постараемся оптимизировать состав панели.

Это звучит очень привлекательно, потому что при работе с количественной ПЦР всегда приходится заказывать несколько пар праймеров, но в случае с SNP вы жестко привязаны к региону генома и мало что можно сделать с последовательностью.

Да, конечно, и увеличение числа маркеров обычно сложная задача, потому что в каждой ПЦР-реакции своя кинетика, но наш подход позволяет увеличивать число маркеров очень эффективно, без дополнительной оптимизации.

То есть все ваши праймеры работают примерно при одной температуре?

Да, верно. Обычно мы используем одинаковые условия реакции, одинаковый протокол на амплификаторе. На одной плашке может находиться несколько панелей сразу, потому что некоторые пользователи не хотят заполнять плашку целиком, им нужен только один тест. Так как условия одинаковые, на плашку можно нанести много независимых тестов.

Компания продает только масс-спектрометр или какое-то еще оборудование для пробоподготовки?

Система MassARRAY® состоит из масс-спектрометра и так называемого модуля приготовления чипов. Этот модуль принимает ПЦР-плашку после амплификатора и переносит образцы на масс-спектрометр. Также мы продаем сами панели и реактивы для всей биохимии. Все, что нужно иметь пользователю, это амплификатор и пипетки (или роботизированные системы для переноса жидкостей). Это то, что называется однородным рабочим процессом: вы наносите образец на плашку, и затем все остальные стадии происходят в ней. Вам не нужны переносы с плашки на плашку или стадии очистки. Эти процедуры можно делать вручную пипеткой, но многие учреждения делают это высокопроизводительно с помощью роботов.

Не думаю, что кому-то очень нравится пипетировать на 384-луночной плашке. Наверно, учреждениям приходится заводить роботов?

У нас лаборатория прямо здесь, и лаборанты и исследователи раскапывают эти плашки вручную постоянно, это входит в привычку. Но я согласен, высокопроизводительные лаборатории предпочитают иметь роботов для манипуляций с жидкостями.

Давайте перейдем к реальным применениям системы. В каких основных областях применяются продукты, которые вы сейчас продаете?

Мы разработали огромное множество панелей. Целевая область для нас — это генетическая наследственность, заболевания, такие, как муковисцидоз и талассемия. Также мы интересуемся фармакогенетикой. Мы смотрим на ферменты метаболизма и пытаемся предсказать, будет ли данное лекарство эффективным для конкретного пациента. Третья область нашей работы — это онкология. Мы анализируем ткани и внеклеточную ДНК, циркулирующую опухолевую ДНК. Также у нас есть ряд панелей на метилирование: MGMT, MLH1 и другие клинически значимые сайты метилирования.

Каков размер, к примеру, вашей фармакогенетической панели? Сколько маркеров в ней?

Как я говорил, мы предлагаем огромное множество панелей, и они могут кастомизироваться. У нас есть очень удобная панель, которую мы обычно используем для фармакологических исследований, она покрывает 21 ген и 74 различных SNP. Это трехреакционная панель. В ней также есть дополнительная лунка для оценки числа копий гена SEP2, поскольку он вовлечен в метаболизм огромного количества разнообразных лекарств и варьирует по числу копий у людей. Для изучения метаболизма лекарств важно знать и гаплотип, и число копий.

Кто ваши основные покупатели? Это академические учреждения или клиники?

Около 90% наших покупателей — это клинические лаборатории. Также это лаборатории, которые разрабатывают тест-системы. В разных странах такие лаборатории аккредитуются по-разному, но это всегда аккредитованные клинические лаборатории молекулярных патологий.

То есть, вы не фокусируетесь на академических исследованиях?

У нас также есть множество клиентов из академической сферы. Наши инструменты применяются для многих целей, вплоть до генотипирования растений и скота и других исследований. Они подходят для таких целей. Но самое масштабное применение, конечно, в клинических исследованиях.

Кстати, я смотрел продукты на вашем сайте и увидел тест на COVID-19.

Да, конечно. Прошлый год был необычным в этом плане. Мы быстро разработали тест на SARS-CoV-2, и для этого мы использовали возможность для масштабирования биомаркеров. Научное сообщество обеспокоено возможностью вируса мутировать, и у нашей панели пять различных мишеней, поэтому она устойчива к возможным мутациям. Сейчас это очень актуально, так как появляются новые штаммы вируса. Эта панель была зарегистрирована FDA для использования в экстренной ситуации. Также мы разработали еще одну панель, только для исследовательских целей, с маркерами вирусов гриппа A и B и SARS-CoV-2.

Сколько времени заняла разработка теста на COVID-19 до выхода на рынок?

Это было быстро. Мы начали разработку в марте и закончили в июне. Выходит, меньше, чем за 3 месяца.

Этим летом появились новые штаммы, например, британский штамм. Ваша панель работает с ним? Планируете ли вы расширять вашу панель?

Наша система надежна по отношению к такой вариабельности, эти мутации не угрожают ее точности. Но мы сейчас разрабатываем панель к этим вариантам, которые вызывают озабоченность научного сообщества, на следующей неделе у нас должен быть открытый вебинар о ней. Умение идентифицировать конкретные штаммы может понадобиться.

Да, в этом был мой вопрос — можете ли вы идентифицировать штаммы.

Да, можем.

Давайте тогда перейдем к неинвазивному пренатальному ДНК-тестированию (НИПТ), к нашей главной теме разговора. В этой области было сделано очень много работ и существуют очень жесткие правила регулировки, насколько я знаю. Насколько я понял, Agena разработала свой собственный НИПТ, но я не нашел об этом информации на вебсайте.

Да, это совершенно новый тест. Мы разрабатывали его по модели партнерства. Наши партнеры из других стран, включая Россию, могут провести собственную валидацию и регистрацию и выйти на локальный рынок. Эти партнеры сейчас на разных стадиях процесса, и вместо глобального выпуска у нас будет регистрация и выход в определенных странах, локально. Когда регистрация пройдет, вы услышите о тесте больше, будет презентация на вебсайте.

Делитесь ли вы со своими партнерами опытом, контролируете ли вы их процесс?

Да, конечно. Мы предоставляем им реактивы, руководства к использованию, помогаем с анализом. Мы сами провели множество внутренних этапов валидации и делимся результатами. Партнеры проводят клинические исследования в своих собственных странах, регистрируют тест в местных надзорных органах.

Расскажите, зачем нужен этот новый НИПТ? В чем его преимущество перед УЗИ и биохимическими тестами?

У УЗИ и биохимических анализов есть известный уровень ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Это скорее подходит для поверхностного широкого анализа, а затем нужно переходить к НИПТ, у которого лучше и чувствительность, и специфичность. Существующие ныне технологии используют подход на основе больших данных: секвенируют огромное количество материала, генерируют большой объем данных и оттого дорого стоят. Они подходят только для особых групп риска. Наши клиенты обратились с просьбой разработать более дешевый высокопроизводительный метод, который можно применить вместо больших данных и лучше отобрать ту часть популяции, которая относится к группе повышенного риска. Так можно выявить риск анеуплоидной беременности, даже если женщина не принадлежит к группе риска по другим показаниям, таким, как возраст. И уже на группе риска проводить дополнительное дорогостоящее секвенирование.

То есть, это пре-скрининг?

Да, вы правильно поняли. Мы проанализировали сейчас более двух тысяч образцов, и чувствительность теста составила более 99%, а специфичность — 94%. Это значит, что наш тест выявляет практически все случаи анеуплоидной беременности (трисомии по 21, 13 и 18 хромосомам) и уже эту группу, в которой повышена частота трисомий, мы отправляем на дальнейшее секвенирование.

Параметры теста впечатляющие. Они такие для каждой из хромосом, входящий в тест? Насколько мне известно, в существующих тестах хромосома 13 является проблемой, специфичность к ней сильно ниже.

Да, это для каждой из хромосом — 13, 18, 21. Чтобы получить эти параметры, мы добавляли в образцы избыточное количество ДНК, но в естественных условиях трисомии по 13 и 18 хромосоме редки. Но да, параметры чувствительности и специфичность приведены для каждой из хромосом в панели.

Мне известно, что вы получили PhD в области неинвазивной пренатальной диагностики.

Да, это так. И в конце моей PhD у меня была возможность использовать технологию MassARRAY. Я изолировал клетки плода из детенышей мышей, этот подход сильно отличается от того, как сейчас их получают из материнской крови. Да, я имею большой опыт в этой области.

Как прогрессировала область со времен вашей PhD?

О, существенно. Когда я делал PhD, мы занимались выделением клеток плода, а не циркулирующих нуклеиновых кислот. Идентификация циркулирующей внеклеточной ДНК плода в плазме крови матери привела к тому, что область начала развиваться стремительно.

Какие методы вы используете для выделения ДНК плода из плазмы крови матери?

В этом смысле мы отличаемся от других тест-систем на рынке. В других тестах берут всю внеклеточную ДНК и секвенируют ее, а затем с применением биоинформатических подходов отфильтровывают последовательности матери, которых большинство, и вычисляют, есть ли вариации в числе копий хромосом плода. Это дорогостоящая обработка большого объема данных. Чтобы снизить стоимость, нам нужно отделить ДНК плода от матери еще до стадии анализа данных. Мы не смотрим ДНК матери, которая составляет основную часть материала, а смотрим только ДНК плода. Мы разработали метод, в котором можем ферментативно разрушить ДНК матери и оставить только ДНК-матрицу плода, которую затем амплифицируем и сверяем число копий хромосом 21, 13 и 18 с остальными хромосомами, чтобы выявить дисбаланс.

То есть ваш метод основан на различиях в уровне метилирования?

Да, подход основан на дифференциальном метилировании. В участках, где ДНК плода метилирована, ДНК матери не метилирована, и ее можно убрать.

Насколько этот метод воспроизводим? Насколько мне известно, количество ДНК плода в материнской плазме значительно варьирует, и как вы преодолеваете трудности, когда ее очень мало?

У нас есть пороговое значение для ДНК плода для получения качественного результата. Если у нас очень малое количество копий, то будет высокий уровень шума. Но число пациентов, которые оказываются ниже порога, очень мало. Доля внеклеточной ДНК плода в плазме может составлять от 3% до 20–30%, а наше пороговое значение меньше этих 3%.

Сколько маркеров вы используете в тесте?

Мы всегда стремимся сделать тесты избыточными для надежности. На каждой хромосоме множество маркеров. Я точно не помню их число, но это несколько дифференциально метилированных регионов на каждой из хромосом. Избыточность нужна в случае, если в регионе вдруг встречается SNP.

Не уверен, что понял, как это работает. Я понимаю, как работает MALDI-TOF для различия последовательностей, но не понимаю, как это работает в случае вариации числа копий.

Итак, мы избавились от ДНК матери, осталась только ДНК плода. Мы амплифицируем эту ДНК в присутствии внутреннего стандарта (синтетической матрицы с однонуклеотидной заменой). Мы знаем, сколько у нас внутреннего стандарта, а значит, можем относительно него измерить количество ДНК плода. Мы сравниваем количества копий разных хромосом. Таким образом, мы работаем и с абсолютным, и с относительным количеством внесенных молекул.

То есть, вы измеряете число копий каждой хромосомы?

Да, хромосом 13, 18, 21.

Но вы сравниваете их количества с остальными хромосомами?

Да, с определенными регионами других хромосом.

Есть ли еще какие-то ограничения метода? Является ли многоплодная беременность более сложным случаем?

Мы пока не валидировали наш подход на многоплодных беременностях. В теории метод может работать, но пока мы не проверяли, не можем это утверждать. Многоплодные беременности с анеуплоидией очень редки, поэтому материал для валидации достать очень сложно. Что касается других ограничений, то так как метод основан на метилировании, а не на SNP, у него нет такого ограничения как этническое происхождение. Регионы метилирования, которые мы используем, очень консервативны и редко подвергаются дупликациям, отличным от трисомий. Фактически ограничений нет.

Собираетесь ли вы дорабатывать тест на что-то помимо трисомий, например, генетические маркеры наследственных заболеваний?

Да, это возможно. Может быть, мы добавим анеуплоидии по половым хромосомам, наследственные доминантные заболевания. Но в прошедший год мы были слишком заняты коронавирусом и пока что не работали в этих направлениях. Так что пока что мы сосредоточены только на трисомиях.

Верно ли я понимаю, что пока что эти тесты на стадии разработки и не применяются в клинике?

Не совсем, сейчас стадия валидации. Мы в компании сделали внутреннюю валидацию на двух тысячах образцов, а наши партнеры делают клиническую валидацию у себя на местах. Мы предпочли такой способ, поскольку на местах много дополнительных параметров: различные наборы для экстракции ДНК, способы транспортировки и хранения. Партнеры сейчас на стадии клинических испытаний.

Расскажите, как такие продукты выводятся на рынок. Как убедить страховые компании, что им нужно платить за новый тест? Как убедить регулирующие органы?

В разных странах все по-разному. Есть вещи, которые всегда требуется доказать для нового продукта: клиническое применение, чувствительность и специфичность, — это стандартные вещи для всех регулирующих органов. Надо сделать сравнения с существующими методами, чтобы показать преимущества для системы здравоохранения и более низкую стоимость.

Можете ли вы сравнить стоимость NGS-тестов и теста Agena?

Это сложно посчитать. Зависит от платформы NGS и так далее. Но в среднем, Agena в 5–10 раз дешевле, иногда и в большее число раз, в зависимости от обстоятельств.

В случае увеличения числа маркеров, насколько я понял, вы можете использовать 384-луночные плашки. И ваш тест предназначен для одной лунки? Сколько маркеров можно разместить на плашке?

Мы используем однолуночную ПЦР, поскольку нужно вначале максимально увеличить количество материала для ПЦР, а затем мы распределяем образец по четырем лункам по числу маркеров. Обычно в 384-луночном планшете мы анализируем 96 образцов, распределенных каждый по четырем лункам. За стандартный рабочий день мы можем проанализировать до восьми плашек.

Есть ли у вас данные, сколько ваших приборов установлено сейчас в России?

Я не знаю точных чисел, я как ответственный за научную составляющую могу ответить про число публикаций, а не приборов. Недавно были очень интересные публикации по масс-спектрометрии из России, поэтому мы благодарны пользователям из России, они дают нам много статей. Я не знаю точного числа приборов в России, но точно знаю, что они есть.

Вы говорили о клинических исследованиях. Есть ли публикации по ним?

Да, есть много публикаций в рецензируемых журналах.

Как обрабатывать материал до его загрузки в прибор?

Мы берем 10 мл цельной крови, собранной в специальные пробирки, стабилизирующие внеклеточную ДНК. Важно, что когда мы отбираем эти 10 мл крови у пациента, в 1 мл содержится около 1 500 копий внеклеточной ДНК в 1мл и около ста миллионов копий ДНК белых кровяных клеток в 1 мл. И если вы не избавитесь полностью от белых кровяных клеток, это создаст существенные проблемы для дальнейшего анализа. После того, как кровь помещена в пробирки со стабилизатором, ее можно транспортировать в лабораторию. Дальнейшая обработка занимает 3–7 дней — отделение плазмы крови, выделение ДНК из нее.

Верно ли я понял, что между сбором образцов и самим тестом проходит около недели?

Да, но это если вам необходима эта неделя для транспортировки в лабораторию. В идеале транспортировка может занимать гораздо меньше времени. Россия намного больше, чем моя страна, и в ней много отдаленных регионов, так что наша система позволяет присылать образцы даже из отдаленных регионов в течение недели.

А как транспортируются образцы? Нужно ли держать их на льду?

При комнатной температуре.

На какой стадии беременности можно проводить ваш тест?

Тест можно проводить на 9–16 неделе. Для более раннего и позднего периода нам необходимо еще проводить испытания. Не думаю, что будут проблемы с более поздними стадиями беременности, но более ранние стадии требуют валидации.

Насколько я понимаю, в случае диагностики чем раньше, тем лучше?

Да, и наши партнеры будут проводить клинические испытания, если им это нужно. В некоторых регионах людям недоступна специализированная медицинская страховая помощь, или же они не могут обратиться к ней до девятой недели беременности.

Можете ли вы назвать страны, в которых этот тест готовится к запуску?

Мы работаем с большим числом стран. Я не могу назвать их все сейчас, поскольку они все на разных стадиях регистрации, но Россия в их числе.

Может быть, вы хотите еще рассказать о чем-то важном, о чем я забыл спросить?

Думаю, сегодня мы много что обсудили. Сейчас я прогляжу свои записи, которые я делал перед встречей с вами. Мы можем поговорить про аналог нашего теста на НИПТ — это тест на внеклеточную раковую ДНК. Тут может быть множество применений, но и трудностей значительно больше, поскольку фракция ДНК плода — это более 3% от всей внеклеточной ДНК, а вот содержание ДНК опухолей значительно ниже. Фактически, мы учимся работать с внеклеточной ДНК на примере НИПТ и пытаемся применить эти знания для рака.

В случае НИПТ вариабельность числа копий ограничена. А в случае рака, если я верно понимаю, вы оцениваете число копий на SNP и сталкиваетесь с частотами минорных аллелей, что наверно делает задачу еще сложнее?

Да, оценка числа копий во внеклеточной опухолевой ДНК — это действительно трудная и интересная задача. Большая часть наших работ по раку ведется на мутациях приобретения функции. Это специфические одиночные замены, небольшие инсерции, которые активируют онкогены и провоцируют неконтролируемую пролиферацию клеток. Механизмы возникновения рака очень разнообразны, поэтому мы используем много биомаркеров.

Если вы тестируете на определенную мутацию, то насколько вы можете быть уверены, что выявили именно ее? Ведь очень важно для конкретного пациента, есть у него эта мутация или нет. Я знаю, что в случае методов секвенирования это проблема, поскольку для правильной диагностики покрытие должно быть сильно выше порогового значения.

Да, для секвенирования это проблемная задача, потому что существуют артефакты. Поэтому разрабатывают специальные биоинформатические алгоритмы, уникальные молекулярные штрихкоды. К нашей технологии это не относится, поскольку у нас нет таких ошибок секвенирования. Мы обеспечиваем высокий уровень чувствительности и специфичности, который достигается благодаря трехуровневому подходу: ПЦР, однонуклеотидное удлинение и затем измерение молекулярных весов масс-спектрометрией. Масс-спектрометр делает 400 измерений в секунду, пролет частицы в трубке занимает всего 3 наносекунды. Это все дает нам высокий уровень уверенности в результатах. Сейчас основная задача — это более ранняя диагностика, работа с болезнью на ранней стадии, что конечно не такая простая задача. У нас есть интересные данные в этой области, которые мы, скорее всего, опубликуем в этом году.

Насколько редкие клетки вы можете выявить? Ведь опухоли очень гетерогенны, и вас может интересовать очень редкая мутация, которая может стать важной позднее, уже после лечения. Можете ли назвать конкретные цифры?

Чувствительность теста с нашей химией составляет 0,1%, то есть один случай из тысячи. Как я уже упоминал, в 1 мл крови содержится около 1 500 копий внеклеточной ДНК, поэтому мы приближаемся к лимиту внесенного количества образца. С аналитической точки зрения, наш тест удивительно чувствителен, может детектировать мутацию в единичной молекуле.

Сколько мутаций вы можете детектировать в циркулирующей опухолевой ДНК, каков размер панелей?

В одной из панелей содержится 5 основных генов из клинических рекомендаций — EGFR, BRAF, KRAS, PIK3CA, ERBB2. Мы оцениваем около 70 мутаций в этих 5 генах.

Насколько я понял, вы не очищаете опухолевую ДНК от остальной ДНК, как это происходит в НИПТ? Вы запускаете тест на всей выделенной внеклеточной ДНК?

Да, это верно, но подходы на основе дифференциального метилирования, которые мы применяем в НИПТ, также могут развиваться для анализа рака. Мы работаем в этом направлении.

То есть позднее можно будет использовать и статус метилирования опухолевой ДНК?

Да.

Это очень интересно. Мои вопросы закончились. Конечно, о раке можно еще много говорить.

Да, но это тема отдельной встречи.

Тогда я хочу вас очень поблагодарить за разговор. Мы обязательно будем дальше следить за Agena и достижениями в области НИПТ.

Спасибо, было приятно поговорить с вами.

Перевод:

Евгения Пуховая