Евгений Денисов: «Наука разделится на до и после пространственной биологии»

28 февраля 1953 года Фрэнсис Крик вошел в кембриджский паб Eagle и объявил, что он и Джим Уотсон «нашли секрет жизни». В марте они собрали огромную трехмерную модель ДНК. А 25 апреля 1953 года, 70 лет назад, журнал Nature опубликовал короткую статью со скромным замечанием в конце: «От нашего внимания не ускользнуло, что постулированное нами специфическое образование пар заставляет сразу предположить возможный механизм копирования генетического материала». Мы предложили современным молекулярным биологам пофантазировать, побыть несколько минут биологами до открытия двойной спирали, а затем немедленно переместиться из этого паба в свою современную лабораторию и представить, что бы их поразило после такого путешествия во времени.

Материал выпущен при поддержке компании SkyGen.

Представьте, что вы только-только прочли знаменитую статью в апрельском номере Nature 53 года о двойной спирали. Потом — бумс! — и оказались у себя в Томске в своей родной лаборатории. Что бы вас больше всего поразило? Методы и инструменты, задачи, которые вы решаете?

Я уверен, что меня поразило бы всё, начиная от автоматической пипетки, заканчивая секвенаторами. Наибольшее удивление у меня бы вызвали секвенаторы массового параллельного секвенирования, та колоссальная способность определять нуклеотидную последовательность даже полного генома всего лишь за чуть более 24 часа. Для примера проект «Геном человека» длился более 10 лет, и за это время расшифровали только один геном. Мы фанаты секвенирования, особенно секвенирования единичных клеток, и пространственной транскриптомики. Сам метод массового параллельного секвенирования поражает своей масштабностью, но то, что было придумано после, буквально лет десять назад, а именно подходы к анализу нуклеотидных последовательностей на уровне единичных клеток... Это гениально простая идея. Нужно всего лишь пометить клетки — сто клеток, миллион — специальными олигонуклеотидными баркодами, и можно их перемешать, не боясь того, что всё содержимое их превратится в кашу, секвенировать и при помощи биоинформатики идентифицировать, из какой клетки пришел тот или иной отрезок нуклеиновой кислоты. В онкологии эти методы крайне полезны, потому что мы всегда сталкиваемся с внутриопухолевой гетерогенностью. И еще меня удивила бы пространственная транскиптомика, анализ клеток с сохранением их топографии, локализации на срезах.

На каких инструментах вы делаете РНК-секвенирование?

У нас стоят инструменты Illumina и новый китайский секвенатор GenoLab M, это полный аналог технологии Illumina. Ну а если мы говорим о химии подготовки библиотек, то здесь спектр у нас достаточно широкий, но из-за санкций нам пришлось большую часть «кухни» закрыть. И вот сейчас одно из перспективных направлений представлено компанией Celemics, которую дистрибутирует SkyGen. Если мы говорим о секвенировании РНК единичных клеток и пространственной транскриптомике, то здесь наша любимая компания — 10x Genomics, их решения называются Chromium и Visium, их продукты тоже представляет в России компания SkyGen.

Вы сказали о секвенировании «на срезах». Я даже не слышал про такое.

Это уникальное решение, я впервые услышал об этом методе лет семь назад, но тогда это были экспериментальные разработки, сейчас же это оформленный коммерческий продукт. Идея, так же как с секвенированием РНК единичных клеток, максимально проста. Используются стекла, обычно это предметные стекла, к которым пришиты олигонуклеотиды, содержащие информацию о расположении. Такие «геометки», пространственные баркоды. 

Просто берется срез какой-то ткани и кладется на предметное стекло?

Да, обычный срез, может быть и фиксированный, то есть полученный из парафинового блока. Идея такая же, как с микрочипами, где пришиты нуклеотиды, только здесь, помимо захвата РНК, они еще и несут в себе информацию о расположении на срезе — у каждого олигонуклеотида в составе есть метка, свидетельствующая о том, где он находился на стекле. И дальше дело химии, мы проводим пермеабилизацию, клетки лопаются, их содержимое уходит вниз, мРНК хватают олигонуклеотиды за поли(А)-хвост. А дальше уже стандартная подготовка библиотек, секвенирование и биоинформатика.

Евгений, учитывая, что вы занимаетесь онкологией... Можно ли старые образцы, которые зафиксированы десять лет назад, взять и использовать таким образом? Или там уже вся РНК развалена?

Можно, но при условии, которое вы сами уже затронули, — сохранения РНК. Перед анализом мы проводим скрининг образцов на качество РНК. Для нас важно брать образцы с уже отслеженной историей, с полной клинической информацией, проводить ретроспективные исследования.

В клинике это еще не применяется?

Нет, это принципиально новая технология, она появилась в продаже в 2020 году. Я затрудняюсь ответить, сможет ли она дойти до клиники и нужна ли она там вообще. Ее достоинство состоит в том, что она позволяет глубоко проникнуть в механизмы взаимоотношения клеток, особенно это важно в опухоли — мы видим, где эти клетки сидят. С помощью бионформатики мы можем определить их лиганды и рецепторы и уже говорить о каком-то конкретном специфическом взаимоотношении, будь это, например, иммуносупрессия или стимуляция метастазирования. Пока я вижу только фундаментальные применения этого метода.

Какие у вашей лаборатории успехи благодаря всем этим методам?

Лаборатория у нас молодая, мы появились в 2019 году, но первые обнадеживающие результаты есть. Мы создавались в первую очередь для изучения механизмов метастазирования. И вот по одному из проектов нам впервые в мире удалось найти определенный ген, полиморфизм в котором предрасполагает к развитию метастазов (данные пока не опубликованы, мы их сейчас валидируем). До этого считалось, что герминальные, то есть наследственные, варианты предрасполагают к риску развития рака определенных типов. И ученые скептически относились к тому, что варианты генетически могут предрасполагать к развитию метастазов. Нам удалось найти такой ген. Ассоциация варианта с метастазированием просто колоссальная, если говорить на бытовом языке, то носители этого варианта имеют стопроцентный риск развития метастазов. При условии, разумеется, если у них развился рак, рак легкого, если конкретнее.

Это какой-то онкоген, да?

Нет, удивительно, но этот ген совершенно не связан с канцерогенезом. Есть идея о том, что это может быть опухолевый супрессор, но пока мы далеко от проверки. Могу сказать, что это вообще ген аппарата Гольджи! Для нас это действительно загадка и челлендж — понять механизм взаимосвязи варианта в этом гене с метастазированием. Тем более речь идет о герминальном варианте, то есть варианте не соматическом, не в опухоли. Это первое достижение. Второе. Спустя года два, как наша лаборатория уже появилась, к нам обратился клинический онколог, хирург Денис Евгеньевич Кульбакин из отделения опухолей головы и шеи, которым руководит наш директор, академик РАН Евгений Лхамацыренович Чойнзонов, с предложением попытаться понять механизмы развития рака полости рта у молодых пациентов и разработать высокоэффективную терапию, потому что эти пациенты плохо отвечают на стандартную терапию, которая эффективна у возрастных пациентов. За два года на нашей базе возник огромный консорциум, в который вошли все крупные онкологические учреждения России. И вот тот метод пространственной транскриптомики, про который я говорил, позволил нам выйти, я считаю, на открытие... Нам удалось определить ключевые молекулярные характеристики этого рака у молодых пациентов. В частности, мы нашли сигнальный путь, который активируется именно у молодых больных, по сравнению с возрастными, и доказали, что в их опухоли активно развивается иммуносупрессия. Сейчас мы приступили к написанию статьи.

А есть что-то, на чем ваша лаборатория споткнулась? Что не удалось?

Есть больной вопрос, он связан не с тематикой нашей лаборатории, а с моими личными амбициями. Но в то же время он поднимает очень важную тему, тему молекулярной диагностики в онкологии, прикладной аспект. Мне очень обидно, видя ситуацию в мире, какими темпами всё внедряется в клинику, видеть то, как это происходит у нас. У нас основная проблема — отсутствие отечественной химии для секвенирования, в частности, для подготовки библиотек по технологии гибридизации. У нас есть идея, мы продолжаем ее развивать, но идет очень тяжело. Мы пытаемся разработать метод для будущего производства мультигенных панелей для массового параллельного секвенирования, но панелей не простых, а с применением технологии гибридизации. Когда используются длинные олигонуклеотиды, порядка более 100 пар. В России нет синтезаторов, которые бы производили эти олигонуклеотиды в большом объеме и достаточно экономически выгодно. Проблема в том, что здесь должен быть именно другой синтез, которого у нас в России нет, — ДНК-печать. А у нас классические синтезаторы, когда синтез идет в пробирку либо в планшеты. Первые проекты появляются: у нас в Томске, в ТУСУРе, разрабатывают первый в России ДНК-принтер, мы с ними активно сотрудничаем. Но первый прототип появится только в конце 2024 года. Пока мы активно смотрим на зарубежные аналоги.

Какой перелом вы считаете наиболее значимым для молекулярной биологии после открытия двойной спирали?

Первое, что мне сразу приходит в голову, — это открытие полимеразной цепной реакции, которое разделило науку на «до ПЦР» и «после ПЦР». Вероятно, это моя профдеформация, я думаю о тех методах, с которыми работаю. Я читал биографию Кэри Муллиса и, при всей критике в его сторону — по ВИЧ-диссидентству, позиции по озоновому слою, — сам момент открытия меня впечатлил. Я все время студентам рассказываю, как ему пришла идея ПЦР, когда он со своей подругой ехал на машине по калифорнийскому шоссе… А сейчас, мне кажется, будет революция с помощью тех методов, о которых я рассказывал. Я говорил только про транскриптомику на срезах, а сейчас появляются разработки по геномике, по протеомике.... Это как с ПЦР, наука разделится на «до пространственной биологии» и «после».

Реклама. Рекламодатель ООО "Скайджин"

Токен - LdtCJyYAv