Гигант нанопорового секвенирования в российской лаборатории

Нанопоровое секвенирование — семейство методов секвенирования третьего поколения. Последовательность нуклеотидов определяется в молекуле ДНК или РНК, проходящей через пору. Секвенаторы, основанные на этом принципе, предлагает британская компания Oxford Nanopore Technologies. Основным их преимуществом обычно называют возможность секвенирования протяженных фрагментов: длинные прочтения (риды) облегчают сборку геномов, особенно участков, богатых повторами и перестройками. Кроме того, нанопоровое секвенирование не требует этапа амплификации нуклеиновых кислот, поскольку читаются единичные молекулы. Это упрощает подготовку библиотеки, позволяет достоверно оценить экспрессию генов и вариации числа копий.

Секвенатор PromethION 24 поставила в ФНКЦ ФХМ ФМБА компания SkyGen, официальный дистрибьютор Oxford Nanopore в России и СНГ (подробнее на PCR.news). Среди других секвенаторов в портфолио компании PromethION 24 и 48 выделяются производительностью — до 200 миллиардов нуклеотидов с одной проточной ячейки, всего в случае PromethION 24 — до 4,8 триллионов на запуск.

На этом мощном приборе сотрудники отдела молекулярной биологии и генетики ФНКЦ ФХМ работают уже больше двух месяцев. Мы поговорили с руководителем отдела Еленой Ильиной о ее впечатлениях.

Елена Николаевна, почему вы выбрали нанопоровое секвенирование? Какие его преимущества для вас были важны по сравнению с классическими методами?

— Это был логичный выбор, чтобы завершить линейку. У нас стоят приборы первого поколения, для секвенирования по Сэнгеру. У нас стоят приборы второго поколения — Ion Proton для полупроводникового секвенирования, Illumina c мостиковой ПЦР. И поэтому вполне разумно было дополнить наши возможности секвенированием третьего поколения. Нанопоровое секвенирование решает кусок биологических задач, связанный со считыванием нативной структуры ДНК без амплификации. Нативная структура — это возможность анализа модификаций. Секвенаторы второго и первого поколения такой возможности не дают, там надо было идти на ухищрения. Сейчас метилом мы снимаем напрямую, легко и непринужденно.

Нанопоровое секвенирование может сразу сказать, какие основания метилированы, а какие нет?

Да, конечно. У нас уже есть опыт получения метильного профиля как генома человека, эукариотического генома, так и бактериального, мы проанализировали нашу коллекцию штаммов хеликобактера. И вот мы видим профиль метилирования без всяких дополнительных манипуляций, непосредственно с прибора.

А то, что он дает особо длинные риды, для вас важно?

Это тоже важно. Немного с другой стороны, там, где речь идет о сборке эукариотических геномов de novo. Геном человека – это, конечно, достойно, но геномами человека занимаются очень многие. У нас есть группа, которая занимается геномами разных других живых существ — это и простейшие, и грибы, черви, пиявки. Здесь мы говорим о поиске новых соединений, новых метаболических путей с акцентом, например, на поиск новых антимикробных препаратов. Например, геном медицинской пиявки — мы первые его сделали, и в том числе часть закрывали с помощью нанопоры.

Ну и то, что мне, как исследователю, работающему в области метагеномики, крайне интересно, это те самые длинные риды, благодаря которым я могу собирать геномы из метагеномов. Когда мы анализируем микробные сообщества, — это может быть микробиота биотопов человека, микробные сообщества естественных резервуаров, озера, реки, всё, что хотите, — там очень много так называемой темной материи. Мы просто не понимаем, что видим. И если мы используем NGS с короткими ридами, очень много этой темной материи так и остается в виде коротких ридов, мы не можем сложить длинные полноценные чтения, которые нам дадут выстроить функционал возможностей.

Как пазл на десять тысяч кусочков. Кусочек есть, но куда его пристроить, непонятно.

Да, да, да! Бактериальный мир изобилует мобильными элементами, геномными перестройками, там идет постоянный генетический дрейф. И это не мутации. Для того, чтобы быстро распознать этот генетический дрейф и обмен мобильными элементами, нужны длинные риды. Тогда у нас закрываются геномы целиком, достаточно легко идет сборка de novo. Именно de novo, потому что когда я по матрице собираю, кажется, что у меня популяция совсем не меняется. А когда начинаешь собирать de novo, оказывается — ой! — этот кусок хромосомы перестроился, а мы и не понимали. Вот это, собственно говоря, те задачи, которые мы сейчас решаем с помощью PromethION.

А что у вас с пиявкой? Это та самая Hirudo medicinalis, известная с древних времен?

Именно! Она изучена достаточно глубоко, выделены активные вещества, которые она продуцирует, сделаны генно-инженерные конструкции, которые позволяют их нарабатывать в бактериальных продуцентах. Изучен геном, транскриптом этой пиявки. Но на эту тему лучше поговорить с доктором биологических наук Василием Николаевичем Лазаревым, это его проект. У меня метагеномы. Сейчас мы закончили большой проект при поддержке гранта Министерства образования и науки — по анализу сигнатуры ответа пациента на противораковую терапию с использованием моноклональных антител. Получили интересные данные, которые показывают, что действительно состав метагенома в какой-то степени предопределяет ответ пациента на терапию. К сожалению, проект уже закончился, мы получили PromethION немного поздно — из-за карантина в этом году все идет не так, задержались с ремонтом помещений. Но я надеюсь продолжить исследования в этом направлении с использованием данного прибора.

Почему именно PromethION, а не, скажем, GridION? Вам нужны были такие большие объемы?

Если мы говорим о метагеномном секвенировании — здесь мало ридов не бывает. Очень богатое микробное сообщество, требуется очень глубокое покрытие, чтобы выявлять низкопредставленные таксоны. Мы сейчас находимся в той стадии развития этого направления геномного и метагеномного секвенирования, когда все, что на поверхности, уже описано. Мы отлавливаем малые эффекты, поэтому нам нужно большое накопление ридов. И экономически всегда выгоднее иметь более мощную машину, когда мы обрабатываем большое количество образцов — глубина покрытия получается дешевле. Поэтому мы выбрали PromethION.

А сколько вы прочитываете в день на нем? Примерно?

Не могу сказать, так мы не считаем. Вы поймите: пара запусков PromethION — и потом несколько месяцев обработки, анализа данных. Потом снова пара-тройка запусков, снова обработка данных. Так устроено геномное секвенирование. Мы планируем, что будет сформирован Центр коллективного пользования ФНКЦ ФХМ — в рамках Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины. И тогда, наверное, будем чаще запускать прибор, он будет работать не только на наши научные задачи, но и на задачи других научных групп. Просто получилось так, что в свое время мы хорошо продвинулись с нанопоровой технологией по геномному секвенированию, поэтому смело пошли на покупку PromethION, понимая, что мы можем обеспечить и хороший сервис для других научных групп, и отвечать за полученные результаты.

У вас есть центр коллективного пользования?

Согласно нашему договору по Центру высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, центр коллективного пользования должен быть сформирован в следующем году. И он будет межлабораторным. В нашей организации не принято приписывание всех мощностей исключительно одной лаборатории. Всегда так было, а сейчас будет оформлено официально, мы образуем ЦКП.

Какие у сотрудников впечатления от нового прибора?

Запуски, которые прошли, достаточно успешны, мы получили даже больше ридов, чем ожидали. Но, повторю, Владислав Бабенко, который работает на этом приборе, имеет хороший опыт работы на нанопоре. Есть бэкграунд, который позволяет из этого прибора извлечь максимум. В общем, пока я слышу только позитивные отклики. Биоинформатики отметили, что математический аппарат использует графические редакторы для обсчета данных, что сейчас считается наиболее производительной моделью для анализа.

Это про софт, который поставляется вместе с прибором?

Да-да. Тоже была задача — мы выделяли место на кластере, проводили туда оптическое волокно для быстрого обмена данными. В общем, софтом тоже довольны.

Многие говорят, что нанопоровое секвенирование менее точное, чем иллюминовское, таких жалоб не было у вас?

Нанопоровое секвенирование менее точное. Но оно ровно такое же, как полупроводниковое секвенирование, которое обеспечивают секвенаторы Proton. Просто в силу химии нанопоровое секвенирование ошибается на гомополимерах, но мы об этом знаем. Когда нам надо прочитать гомополимеры, если честно, я вообще предпочитаю Сэнгера. Самый старый, классический метод секвенирования, единственный, который очень четко прочитывает такие фрагменты. На гомополимерах возникали проблемы почти у всех платформ по секвенированию. В принципе, меня это не смущает. Потому что глубокое покрытие, допустим, 100-кратное, если сравнить по цене запуска нанопоровое секвенирование либо «Иллюмину», — нанопоровое получается существенно дешевле.

У каждого метода есть плюсы и есть минусы, и это не секрет.

Конечно, в этом нет никакого секрета. Тем более эти длинные гомополимеры, как правило, находятся в местах генома, которые не относятся к открытым рамкам считывания, это неинформативные участки, и если говорить именно о поиске мутации, то они вообще не мешают. Если говорить об анализе какой-то микросателлитной гетерогенности — да, они мешают, тогда просто другой движок используем, имея полную линейку от первого до третьего.

Спасибо!