Когда белки станут активными?

Так получилось, что я работал в этом институте два года — делал курсовую и диплом во время учебы в МГУ — и поэтому знаю Славу Колба с того самого времени в 90-е, когда он готовил нам, зеленым студентам, лучший кофе в семинарской под номером 231 и в целом в природе. Мы на «ты», другое обращение выглядело бы глупо. Да и не кичится человек своим положением. Так что читайте о фолдинге, то есть о том, когда и как сворачивается белок.

Интервью взято до 24 февраля 2022 года.

Вячеслав, в вашей работе вы показали, что молекула белка сворачивается в окончательную форму сразу после того, как заканчивается его синтез в клетках. Буквально в течение секунд после того, как она покидает рибосому. Почему это важно знать?

Наша работа полностью соответствует настоящему предназначению науки как таковой. То есть мы не изобрели способ лечения какого-нибудь страшного вируса, отнюдь. И к сожалению. У науки есть другая и, в действительности, единственная роль, которая состоит в постоянном критическом переосмыслении действительности. И нахождении того, что не вписывается в старую картину мира, что связано с так называемой мистикой, что требует объяснения с помощью каких-то потусторонних сил. И здесь наука должна вмешиваться и выяснять, в чем же дело, исправлять старую картину бытия и создавать новую, лучшую, которая тоже впоследствии, скорее всего, будет исправлена. Вот мы и занялись этим вопросом, поскольку не давала покоя следующая странная вещь. Вручили Нобелевскую премию Кристиану Анфинсену за то, что он показал надежно и четко, что для сворачивания белка не нужно ничего — ни внешних источников энергии, ни дополнительной информации — кроме последовательности аминокислот в составе этого белка. Он из полностью развернутого состояния — из «статистического клубочка» — сам уложится, только ему не мешать. Это прекрасное открытие, важный кусок знаний. Но кто сказал, что белки всегда, в любой ситуации будут укладываться из полностью развернутого состояния, без окружения чего бы то ни было? Такого практически не бывает.

Когда была сделана работа Анфинсена?

Это работа 70-х годов. Ее оценили, хотя впервые результаты были опубликованы в бог знает каком журнале. И Анфинсен получил Нобелевскую премию. Опыты очень изящные — он следил за тем, как по мере сворачивания белка рибонуклеазы его цистеины образуют правильные 4 мостика.

Цистеин — это природная аминокислота, у которой есть тиольная группа — сера с водородом, S-H. В окислительных условиях два цистеина могут связаться друг с другом ковалентной (прочной) связью, образовав мостик S-S. Такой мостик — это скрепка в структуре белка, сшивающая участки цепи с цистеинами, образовавшими мостик. Если такой мостик образовали не те цистеины, которые для этого природой предназначены, белок не свернется в правильную, биологически активную структуру. Цистеиновые мостики образованы правильно только в глобуле правильно свернутого активного белка.

Эксперименты проводились с рибонуклеазой, Анфинсен исходил из постулата, что только правильно свернутый белок обладает биологической активностью. То есть возникновение активности было главным критерием правильного сворачивания.

Наверное, здесь нужно немного рассказать про трансляцию, то есть механизм синтеза белка вообще: как его молекула растет?

Белок синтезируется на крупной молекулярной машине весом 3 миллиона дальтон, она называется рибосомой. Синтез белка матричный — есть матричная РНК, в ее последовательности нуклеотидов закодирована очередность аминокислот, которые должны быть присоединены к растущей цепи белка. Синтез начинается с N-конца белка — у каждой ниточки есть два конца, N и C. Из рибосомы высовывается N-конец, а С-конец все время наращивается присоединением следующей аминокислоты. Какая будет следующая, диктует матричная РНК. В хороших условиях синтез проходит со скоростью 30 аминокислотных остатков в секунду. Это у бактерий, у нас с вами — десяток в лучшем случае. То есть нормальный белок из, допустим, 300 аминокислотных остатков — это в хороших условиях 10 секунд на синтез.

А в ваших экспериментах какой белок использовали?

Люциферазу светлячка. Там 550 аминокислотных остатков. Но поскольку мы работали в бесклеточной системе трансляции, а не в клетках, — эта система более разбавленная, — там все происходит медленнее. И синтез у нас шел 10 минут. От начала и до конца. В общем, мы решили посмотреть, как быстро после того, как белок построен, он может свернуться в активную люциферазу, способную излучать свет.

То есть активность люциферазы можно определить по тому, что она начинает излучать свет?

Да. У нее есть субстрат, который называется люциферин, она берет его, берет кислород, растворенный в воде, берет АТФ, который тоже плавает вокруг, и из этих трех компонентов делает окислительную реакцию. Люциферин окисляется до оксилюциферина, при этом молекула возбуждается, переходит в другое квантовое состояние и потом сваливается по энергии вниз, а при этом излучает квант света. И этот квант света желто-зеленый, хорошо виден глазом или люминометром, его можно поймать и понять, что у вас есть готовый фермент, правильно свернутый, и он работает. Вот синтез этого фермента мы изучали. А хорошим знаком для нас оказалось то, что этот самый люциферин, субстрат люциферазы, оказался не ядовитым для трансляции. Его можно было добавить прямо к клеткам или прямо к бесклеточной системе. Он никого не травил, все системы в его присутствии работали хорошо.

Светлячок Photinus pyralis | flickr.com | Terry Priest

Структура люциферазы светлячка | Public domain | wikipedia.org

Что такое бесклеточная система трансляции? Не каждый биолог знает. А в Институте белка работа с такими системами была на поток поставлена.

Бесклеточная система трансляции? Это когда взяли бактерии, вырастили их, собрали, отмыли, а потом разрушили оболочки и все, что внутри содержалось, — цитозоль, извлекли, и в этом цитозоле разрушили ДНК и матричные РНК. Остались только рибосомы и все необходимое для синтеза белка, но не осталось матриц, которые этот синтез белка диктуют. Ни на ДНК-уровне, ни на РНК-уровне. То есть мы уничтожили контроль.

Ты говоришь про бактериальную систему трансляции, а в статье у вас, кажется, зародыши пшеницы…

Бесклеточную систему можно приготовить и из клеток эукариот, верно. У нас была система и бактериальная, и пшеничная. Но в статье данные только по пшеничной, верно. В общем, бесклеточная система — это система, где контроль за синтезом перехвачен исследователем. Где мРНК, которую транслируют рибосомы, добавлена исследователем, а не сделана в клетке. И новая мРНК сделаться не может, потому что ДНК «убита», ДНК генома нет, транскрипция не идет. И все в наших руках, мы — царь и Бог.

Лаборатория Александра Сергеевича Спирина в Институте белка, где мы делали эту работу (а ты сотоварищи — свои дипломы), была самой лучшей в мире на тот момент по бесклеточным системам. В ней они развивались, изобретались новые их варианты, и это было наше преимущество — мы умели делать очень хорошие системы и умели следить за продуктами трансляции.

Что мы должны добавить в эту систему, чтобы она заработала и начала синтезировать люциферазу?

Матрицу люциферазы, то есть мРНК, аминокислоты, АТФ, ГТФ и — чтобы фиксировать появление люциферазы — люциферин. Все остальное там присутствует.

Чья идея была сделать эту работу?

Я помню, это было в семинарской, в 231 комнате. Мы сидели и пили чай. Был Женя Макеев, и я. Кто первый сказал: «А давай капнем РНКазу в систему трансляции, когда она уже разгонится?» — я не помню.

Женя ведь был еще маленький тогда, студент?

Но он был очень умный! И вполне мог это предложить. Сейчас он профессорствует где-то в Англии.

Вы сами решили проверить идею или сначала пошли к академику Спирину?

Спирин узнал об этой работе, когда она была уже защищена в виде диплома Макеева. Даже более того — через год после защиты. И Спирин требовал от меня публикации: «Что вы там возитесь, вам нечего публиковать?!» И я сказал, что есть интересные данные. Спирину понравилось безумно! После этого он услал меня в Штаты, статью я дописывал уже там. Был на связи с Макеевым, он еще ставил некоторые эксперименты, которые требовали наши оппоненты… Продолжаю историю. Мы решили проверить, как долго готовая люцифераза сворачивается в активную люциферазу. «Готовая», значит, у нее вся длина уже есть. Полипептидная цепь уже есть полностью, и она сошла с рибосомы. Наверное, ей нужно какое-то время, чтобы правильно уложиться? И мы этот промежуток времени померили, добавив ингибиторы трансляции. Это могла быть та же самая РНКаза А, которая уничтожает мРНК очень быстро, и также очень быстро портит тРНК — транспортные РНК, молекулы, которые носят аминокислоты в рибосому, чтобы присоединить их к белку. Это такой хороший трансляционный яд. То есть, мы взяли систему, которая работает, и капнули туда яд. И посмотрели, как долго после добавления яда активность люциферазы как фермента будет еще нарастать. И оказалось, что мы не можем это время померить, оно очень короткое. В нашей шкале — ноль! Наверное, какие-то микросекунды.

Это значит, что укладывание цепи в какую-то пространственную структуру происходит во время ее роста. Присоединилась очередная аминокислота — что-то изменилось в структуре уложенной растущей цепи. И когда присоединяется последняя аминокислота, все уже практически готово, потому что все происходит страшно быстро.

Но для того, чтобы увидеть, как прекращается накопление активной люциферазы, нужно сначала увидеть, как она накапливается, да?

Да, мы измерили, как быстро у нас появляется ферментативная активность. Это делается в люминометре, маленьком таком приборе, прямо в ячейке. И одновременно мы посмотрели, как быстро у нас появляется полоса полноразмерного белка на электрофорезе. Смотрели с помощью радиации —добавляли радиоактивные аминокислоты, и синтезированный белок у нас получался радиоактивный. И из этого первого эксперимента уже было понятно, что активность люциферазы мы уже можем измерять, а полноразмерного белка еще на форезе не видим, потому что его очень мало. Поэтому было понятно, что долгой задержки между появлением полноразмерных молекул и светимостью нет.

Так, может, фермент еще на рибосоме становится активным?

Нет. Было раньше (и не нами) показано, что люцифераза нужна именно полная. Если у нее «откусить» всего 12 аминокислот с ее С-конца, то она будет неактивной.

Еще одним важным моментом в этой работе было то, что мы посмотрели, как этот белок сворачивается из полностью развернутого состояния в тех же физико-химических условиях. В том же растворе, с той же температурой и т.д. Система трансляции, где все то же самое, только нет мРНК. И оказалось, что люцифераза — вовсе не чудесный белок, что она в системе трансляции из полностью развернутого состояния сворачивается плохо, медленно. В эукариотической пшеничной системе полувремя сворачивания минут 15, а у прокариот в E. coli — вообще часы. Очень медленный процесс, потому что за разумное время, за 8 часов, восстанавливается ничтожная часть активности исходного белка, который мы развернули в мочевине, а потом впрыснули в систему трансляции, чтобы мочевину разбавить и заставить белок сворачиваться.

Правильно ли я понимаю, что в статье описываются альтернативные варианты сворачивания, которые предлагались на тот момент? Не прямые? Можно ли сказать, что эта работа поставила логическую точку в десяти-пятнадцатилетних рассуждениях о том, как же все-таки белок принимает ту конформацию, которая нужна?

Это была хорошая работа. Она решила одну важную задачу — экспериментально показала, что котрансляционное сворачивание, которое предполагалось, но никем не было убедительно показано, действительно происходит. Что белок сворачивается в основном во время собственного роста. А уйдя из рибосомы, он практически мгновенно становится правильно свернутым. Здесь точка была поставлена. Был получен ответ на эту странность — кто же поддерживает в развернутом состоянии растущую полипептидную цепь? А никто! Нет никакой развернутой полипептидной цепи. Она по мере роста сворачивается сама.

Мы, конечно, не ответили, во что она сворачивается и насколько эта полуготовая конфигурация цепи напоминает нативную укладку. На этот вопрос мы не ответили, это тяжелая задача, но она и до сих пор не решена. Попытки, впрочем, делаются. Лет семь назад вышла работа Родниной и Комара, где они следили за очень короткими растущими пептидами на рибосоме и тоже показали, что они сворачиваются во что-то необычное, не похожее на то, во что они свернуты в природной, нативной структуре биологически активного белка.

Насколько это общее правило для всех белков? Например, есть белки, которым для активности нужно быть комплексом, не мономером…

Пока хороших работ, которые опровергали бы это правило, нет. Я уверен, что должны быть исключения. Например, мультисубъединичные белки или неглобулярные белки. Но пока все, что мерили, оказывалось похожим на нашу работу. Была одна работа, но она была очень странной. Искусственные белки вроде бы не хотели сворачиваться на рибосоме, им надо было освобождение из рибосомы и солидное время, чтобы прийти к окончательной конформации в присутствии шаперонов (помощников сворачивания белков). Но там был очень странный контроль, и не один: «как заставить шапероны молчать? Шапероны потребляют АТФ, поэтому давайте добавим апиразу, которая АТФ разрушит полностью, и шапероны перестанут работать». Да, разрушит! А откуда тогда рибосома возьмет аминоацил-тРНК? Ведь для того, чтобы аминокислоту присоединить к тРНК, тоже нужен АТФ, а мы его разрушили... Но у них тем не менее трансляция шла в присутствии апиразы. И эта работа опубликована в Cell.

Хороший журнал…

Но она до сих пор вызывает у меня шок. И у многих людей, чье внимание я обращаю на эту странность: как же в присутствии апиразы может идти трансляция? Люди тоже начинают чесать в затылке и потом хохотать.

Так. Это был следующий вопрос. Шапероны ведь все равно нужны? Хотя бы для некоторых белков? Иначе ведь они могут неправильно свернуться.

Могут. Там смотри как устроено: на рибосоме на выходе сидит в засаде такой триггер-фактор. Это я о прокариотических рибосомах. В эукариотах сложнее, там слишком обильная «каша», очень много компонентов. Но у прокариот сидит триггер-фактор, который встречает, наверное, каждую из этих самых цепей, и узнает ее опасные районы, потому что они липкие. На нее залипает, дает им возможность не залипнуть больше ни на что, и когда белок уже готов — отцепляется от цепи, уходит от полипептидной цепочки и дает последнему участку довернуться до нужной структуры, не мешая ему. Если его в нужное время не оказалось, то тогда белок сворачивается неправильно, но на этот случай есть обильные и разнообразные системы спасения. Которые тоже завязаны на шаперонах — они или разворачивают цепь и дают ей новый шанс свернуться, или разворачивают ее и кромсают с помощью протеазы до аминокислот. То есть можно и уничтожить неправильно свернутый белок, а можно дать ему второй шанс свернуться. Видимо, здесь клетка умеет определять, насколько все плохо.

Были ли какие-то работы за 27 лет после вашей публикации, где было прямо показано, как сворачивается растущая цепь белка? Хотя я не могу себе представить, как это можно сделать: огромная рибосома едет по матрице с огромной скоростью... Завод на колесах просто.

На самом деле, рибосома — это не самый жуткий ужас. Самый жуткий — это транскрипция. Там громадные комплексы. В прокариотической рибосоме 50 с небольшим белков, в эукариотической — 70. А там — 200, да еще и с разными РНК. Вот самый ужас там. Но вопрос про работы: да, были работы, когда были показаны прямые контакты между растущей цепью и шаперонами. Это были работы Хестеркампа, Мартина Видмана. Они вводили фотоактивируемую метку в состав аминокислот, из которых строился белок. А потом освещали эту систему ярким светом. Фотоактивируемая метка разваливалась и ковалентно пришивалась к чему угодно, что находилось рядом с этим аминокислотным остатком. И так были обнаружены взаимодействия растущей цепи с Hsp70 — шаперонами, и с комплексом NAC, это такой белок, который в эукариотах взаимодействует с растущей цепью. Он предотвращает взаимодействие растущей цепи с комплексом SRP и шаперонами. А SRP, в свою очередь, — это сигнал-узнающая частица, узнает сигнальный сегмент на растущем пептиде, останавливает синтез. Потом вместе с рибосомой идет в транслокон, то есть пору на мембране или на эндоплазматическом ретикулуме.

То есть, если белок должен выйти не в цитозоль, а куда-то наружу или в эндоплазматический ретикулум, то его сворачивание нужно остановить, а потом как-то возобновить в нужном месте?

Да, абсолютно так! Поэтому в просвете, в люмене эндоплазматического ретикулума плавают шапероны, которые узнают эту растущую цепь, приклеиваются к ней, и не дают свернуться.

И поэтому в эксперименте, о котором ты говоришь, употребляли ингибиторы этих SRP, чтобы они не действовала как сигнал для того, что не надо сворачиваться?

Да, примерно так.

Уфф. Стоп! Я уже теряю нить. Очень сложно все это устроено. Давай вернемся к вашей работе. Вы пишете, что это была новаторская методика, а чем она новаторская? Люциферазу вроде бы уже употребляли в дело?

А никто не догадывался, что ее можно синтезировать, поместив пробирку прямо в люминометр. То есть следить за выходом активной люциферазы, прямо его мониторя. Это была хорошая догадка — засунуть пробирку с работающей системой трансляции в люминометр и впрыскивать в нее все, что душа попросит, прямо по ходу дела через маленькую дырочку в пробке.

Эксперименты сразу пошли хорошо или были какие-то затыки? Не бывает же так, чтобы сразу все хорошо?

Здесь природа сдалась. Мы с Макеевым получили результаты очень быстро. Я думаю, что здесь еще и хорошие руки Жени, он молодец, с головой и с руками. И мы сразу же обрадовались, сразу же поняли, о чем это, сразу стали писать и придумывать новые опыты. Я думаю, что был и элемент везения. Это благодарный объект — глобулярный белок, типичный, у него хорошая активность, легко измеряемая, и субстраты, которые не ингибируют трансляцию. Ряд везений.

Сколько времени занимает серия экспериментов такого рода, со всеми контролями?

У нас это заняло около четырех месяцев. Грубо говоря, полгода. И уже можно было публиковать. Но до этого надо было много чего налаживать. Например, самым трудным было уговорить человека отдать нам люминометр на некоторое время. Потом он его забрал назад. Надо было найти хорошие плазмиды с последовательностью люциферазы, так, чтобы транскрипт хорошо получался и хорошо узнавался эукариотической трансляционной системой. Ведь не любой транскрипт, не любая РНК будет хорошо транслироваться в бесклеточной системе, да и в клетке тоже. Надо было такой 5’- нетранслируемый кончик сделать, чтобы инициация трансляции хорошо проходила. Еще нам повезло, что у нас в эукариотической системе пошла трансляция без кэпа. И так далее.

Я ведь в 92-м был еще на стажировке в Пущино. Это же самое мрачное время для города. А вы работали…

Значит, ты ходил рядом. Женя работал со мной, на первом этаже. Он был таким худеньким темноволосым мальчиком. Но да, было страшновато. Нас в Белке в 1995-м посетил Мартин Видман. Это тот самый, кто открыл NAC. Мы с ним почти попали в перестрелку в ресторане в Пущино. Там ужинали бандиты, и один из них выстрелил по стопке салфеток, чтобы они разлетелись.

Давай завершим на чем-нибудь позитивном, не про бандитов. Хотя вспомнить приятно. В каком состоянии сейчас находится наука про то, как белок сворачивается? И зачем она вообще нужна?

Просто есть то, что называется «вызов». Если для того, чтобы белок свернулся, не надо ничего, кроме его последовательности, давайте по его последовательности предскажем, во что он свернется. Эта задача до сих пор не решена. К ней очень близко подошли, ее делает искусственный интеллект, не люди.

Программы становятся все лучше и лучше.

Но все равно не идеальны, и все равно ничего не получается, если у тебя нет гомологов этого белка с известной структурой.

То есть, если белок совсем новый, то?

То ты сидишь в луже. То есть эта задача не решена. И я, например, думаю, что решать ее надо только лишь с учетом растущей цепи. Надо сворачивать не окончательную цепочку, а пошагово. Мне кажется, что так никто не делает, хотя совсем недавно, буквально на этой неделе, появилась публикация Кунина, который ставит под сомнение, что структура белка — это минимум свободной энергии. Так что очевидно, что задача до сих пор важная, до сих пор не решенная. И мы пытались внести некий вклад в нахождение пути ее решения. А получили в итоге, если говорить о приземленной пользе от наших данных, очень хороший инструмент для изучения трансляции.