Методы анализа метилирования ДНК. Возраст преступника, молекулярная онкология, благополучие кораллов

1. Что такое метилирование ДНК и зачем его изучать

2. Бисульфитная конверсия: как это работает

3. Гидроксиметилирование — еще одна модификация, о которой нужно знать

4. Метилсвязывающий белок — альтернативный способ обнаружения метилированной ДНК

5. Гайд по подбору реагентов для вашего эксперимента

1. Что такое метилирование ДНК и зачем его изучать

Метилирование ДНК заключается в присоединении метильной группы в 5-ю позицию пиримидинового кольца цитозина в составе CpG-динуклеотида — участка ДНК, где цитозиновый и гуаниновый нуклеотиды соединены фосфодиэфирной связью. Эту реакцию осуществляют ферменты ДНК-метилтрансферазы, которые образуют и поддерживают паттерны метилирования ДНК в геноме. Такая модификация происходит без изменения самой последовательности ДНК и, таким образом, относится к эпигегенетическим изменениям. Метилирование достаточно стабильно и передается дочерним клеткам в ходе митоза, однако различные факторы могут влиять на состояние эпигенома в течение жизни.

Паттерны метилирования ДНК в промоторах, самих генах и энхансерах играют жизненно важную роль в регуляции экспрессии генов. Гиперметилирование ДНК в промоторных областях обычно связано с супрессией генов. Например, это необходимо для инактивации Х-хромосомы и «молчания» повторяющихся участков ДНК. В энхансерах представлены паттерны метилирования ДНК, специфичные для тканей или клеток. Такие дифференциально метилированные области (DMR) могут способствовать уникальной экспрессии генов в различных типах тканей и клеток.

Метилирование ДНК считается присущим в основном эукариотам. Около 60–70 % всех CpG-динуклеотидов у млекопитающих метилированы. Неметилированные CpG-динуклеотиды сгруппированы в так называемые CpG-островки, которые присутствуют в 5'-регуляторных областях многих генов, например генах «домашнего хозяйства». Различные заболевания, в том числе рак, сопровождаются начальным аномальным гипометилированием ДНК и последующим гиперметилированием таких CpG-островков.

Исторически для анализа паттернов метилирования применялся рестрикционный анализ. Использовалась пара ферментов — HpaII и MspI, которые могут распознавать последовательность CCGG, но рестриктаза HpaII не способна разрезать ДНК, в которой метилирован внутренний цитозин. Полученные после рестрикции фрагменты можно анализировать разными способами: масс-спектрометрия, саузерн-блоттинг, лигирование с мечеными нуклеотидами, ПЦР и другие. К недостаткам этого метода можно отнести то, что не все CG расположены в последовательностях CCGG, и это может быть причиной ложноотрицательных результатов, а также то, что для проведения анализа необходимо не менее 0,5–1 мкг ДНК.

В настоящее время производители предлагают для анализа паттернов метилирования ДНК решения на любой вкус — выбор зависит от цели и задач эксперимента, осведомленности и фантазии исследователя, а также от бюджета. В зависимости от желаемой точности анализ может быть проведен с разрешением до одного нуклеотида либо с меньшим, до 100–500 нуклеотидов. В первом случае используют в основном методы NGS-секвенирования или количественной ПЦР, но могут быть выбраны и классическая ПЦР, секвенирование по Сэнгеру или пиросеквенирование – главное, чтобы изучаемая ДНК была предварительно подвергнута специальной модификации – бисульфитной конверсии. Во втором случае применяют те же методы, но вместо бисульфитной конверсии проводят преципитацию метилированной ДНК со специфичными антителами либо захватывают её метилсвязывающим доменом (MBD) человеческого белка MeCP2.

2. Бисульфитная конверсия: как это работает

Золотым стандартом качества экспериментов по изучению метилирования ДНК считаются подходы с использованием бисульфитной конверсии. Эта технология основана на химической модификации неметилированного цитозина в урацил бисульфитом, при этом метилированные цитозины защищены от превращения. Таким образом, последовательность ДНК изменяется в зависимости от ее паттерна метилирования. После такого воздействия можно установить, какие CpG-динуклеотиды были метилированы, сравнив измененную последовательность с исходной. Для анализа такой измененной последовательности могут быть выполнены NGS, сэнгеровское секвенирование, пиросеквенирование, специфичная для метилирования ПЦР, анализ кривой плавления, подходы на основе микрочипов. К преимуществам этого подхода можно отнести высокую точность (до одного нуклеотида), совместимость с NGS-технологиями и возможность проведения полногеномного (WGBS) или таргетного анализа (RRBS).

 Бисульфитная конверсия превращает остатки цитозина в урацил, но не затрагивает остатки 5-метилцитозина

Наиболее подробно паттерны метилирования ДНК могут быть проанализированы с помощью набора Premium Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS) kit от Diagenode (C02030034). Он включает реагенты как для бисульфитной конверсии, так и для подготовки библиотеки и позволяет провести полногеномный скрининг паттернов метилирования ДНК с использованием платформ Illumina. Кроме того, он подходит для подготовки библиотеки из образцов, подготовленных для иммунопреципитации хроматина (ChIP), что позволяет провести ChIP-Bis-секвенирование. Для мультиплексирования производитель предлагает собственный набор из 12 индексов (C05010033).

Например, с помощью данного подхода исследователи из США изучили эпигенентическую пластичность мюллеровской глии у мышей и ее потенциал в качестве инструмента для восстановления сетчатки. Они показали, что клетки Мюллера эпигенетически ближе к поздним клеткам-предшественникам нейронов сетчатки, чем к ранним, имеют репрессивную структуру хроматина и сильно метилированную ДНК в промоторных областях многих генов, которые необходимы для развития ранних нейронов сетчатки. Это препятствует возможности регенерации всей сетчатки млекопитающих из клеток Мюллера, и для их перепрограммирования и дифференцировки в фоторецепторы палочек может потребоваться деметилирование ДНК.

Для более экономичного и целенаправленного анализа метилирования ДНК на уровне одного нуклеотида в масштабе генома любых видов позвоночных Diagenode предлагает набор для бисульфитного секвенирования с ограниченным набором локусов (RRBS) — Premium RRBS Kit V2 (C02030036). В данном методе сначала разрезают ДНК ферментом рестрикции MspI по сайтам-мишеням CCGG, затем достраивают концы и пришивают адаптеры, проводят отбор по размеру, обогащают образец ДНК биологически значимыми участками, содержащими CpG, и только потом проводят бисульфитную конверсию, амплификацию библиотеки, очистку и сам анализ.

 Набор Premium RRBS Kit V2. Credit: SkyGen

Набор Premium RRBS Kit V2 позволяет работать с низкими количествами ДНК (от 25 до 100 нг) и идентифицировать около 4 миллионов CpG в образцах от человека, изучая паттерны метилирования в областях, где обычно находятся метки метилирования ДНК, включая промоторы и CpG-островки. Комплект включает все реагенты, необходимые для подготовки библиотеки. Существует расширенная до 96 образцов версия набора (C02030037), что позволяет запускать их в анализ параллельно, экономя время на обработку и снижая затраты на один образец благодаря стратегии раннего пулирования. Также для оптимального мультиплексирования производитель предлагает собственное программное обеспечение (SIP), уникальные адаптеры, содержащие двойные индексы (UDI) и молекулярные идентификаторы для поиска и удаления дупликатов (UMI) ( C02030040, C02030041).

С помощью такого подхода американские ученые исследовали паттерны метилирования у мышей с гепатоцеллюлярной карциномой, ассоциированной с неалкогольным стеатогепатитом. При прогрессировании заболевания у мышей с ожирением появилось большее количество дифференциально метилированных областей (DMR) по сравнению с мышами без ожирения. При этом у мышей с ожирением развитием болезни может управлять механизм гипометилирования генов, связанных с сигнальным путем Wnt. Прогрессирование гепатоцеллюлярной карциномы у худых мышей может быть обусловлено другими сигнальными путями, включая метаболизм липидов. По мнению авторов, дифференциально метилированные области могут служить биомаркерами прогрессирования рака или мишенями для новых эпигенетических терапевтических средств.

Если же исследователю необходимо провести только бисульфитную конверсию, то набор Premium Bisulfite Kit от Diagenode позволяет это сделать всего за 60 минут (C02030030). Реагент добавляется непосредственно к ДНК, не требует промежуточных стадий и обеспечивает высокий выход ДНК, готовой для последующих анализов, включая ПЦР и NGS.

 Набор Premium Bisulfite Kit. Credit: SkyGen

Этот набор применяла международная команда, которая разрабатывала усовершенствованный инструмент для оценки возраста по образцам спермы с использованием количественного анализа метилирования ДНК. Данная методика будет применяться в криминалистике; ее валидировали лаборатории проекта VISAGE (VISible Attributes through GEnomics). Она включает этап бисульфитной конверсии, за которым следует расширенный анализ 13 сайтов-кандидатов CpG с помощью двух мультиплексных ПЦР или упрощенный анализ 5 сайтов-кандидатов в одной мультиплексной реакции. Валидация тестов проведена с использованием NGS на платформе MiSeq в нескольких лабораториях независимо друг от друга.

При планировании экспериментов с использованием методов на основе бисульфитной конверсии необходимо учитывать их возможные ограничения. Например, воздействию бисульфита могут быть подвержены только цитозины в одноцепочечной ДНК, поэтому денатурация двухцепочечных молекул имеет решающее значение. Важно убедиться, что такие параметры реакции, как температура и концентрация соли, подходят для поддержания ДНК в одноцепочечной конформации и обеспечивают полную конверсию. Кроме того, существует проблема деградации ДНК при обработке бисульфитом. Высокая температура и длительный период инкубации могут привести к деградации до 90 % всей ДНК.

3. Гидроксиметилирование — еще одна модификация, о которой нужно знать

Наконец, у млекопитающих широко распространена другая эпигенетическая модификация ДНК – наличие 5-гидроксиметилцитозина. При обработке бисульфитом 5-гидроксиметилцитозин превращается в цитозин-5-метилсульфонат, который при секвенировании опознаётся как цитозин. Таким образом, бисульфитное секвенирование не может различить 5-гидроксиметилцитозин и 5-метилцитозин.

Современные коммерческие наборы учитывают эти ограничения и позволяют обойти их. Кроме того, созданы протоколы проведения окислительного бисульфитного секвенирования для анализа 5-гидроксиметилцитозина (oxBS-Seq), TET-ассоциированного бисульфитного секвенирования (TAB-Seq), и совсем недавно, секвенирования на основе обогащения с разрешением до одного основания (EBS-seq).

Различить 5-гидроксиметилцитозин и 5-метилцитозин поможет специальные комплекс методов — иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP или hMeDIP). Технология основана на аффинной очистке метилированной ДНК с использованием антител, направленных против 5-метилцитозина (5-mC) или 5-гидроксиметилцитозина (5-hmC).

MeDIP выполняется следующим образом: геномную ДНК из культивируемых клеток или тканей подготавливают, разрезают и денатурируют. Затем проводят иммуноселекцию и иммунопреципитацию с использованием антител против 5-метилцитозина и шариков, связывающих эти антитела. После выделения и очистки такая ДНК готова для любого последующего анализа, например, с помощью количественной ПЦР, гибридизации на микрочипах или NGS. Преимущества метода — возможность работы с немодифицированной ДНК, высокий выход, надежность и воспроизводимость, совместимость с NGS.

 Набор Premium Bisulfite Kit. Credit: SkyGen

Для реализации этой стратегии Diagenode предлагает набор MagMeDIP Kit (C02010020, C02010021). В его составе есть все необходимые реагенты для выделения ДНК, иммунопреципитации (включая антитело 5-mC, контроли и соответствующие им пары праймеров для количественной ПЦР) и последующей очистки ДНК. Набор позволяет работать с исходным количеством ДНК от 10 нг до 1 мкг, совместим с qPCR и NGS.

 Обзор протокола работы с набором MagMeDIP для различных приложений. Credit: Diagenode

При сочетании набора MagMeDIP с NGS производитель рекомендует следующую стратегию:

1) выбрать реагентику для подготовки библиотеки, совместимую с тем количеством ДНК, которое планируется использовать (от 10 нг до 1 мкг);

2) выбрать подходящую систему индексов;

3) подобрать протоколы для подготовки библиотеки, которые совместимы только с двухцепочечной ДНК, причем первые этапы подготовки библиотеки (восстановление концов, А-хвост, лигирование адаптера и очистка) должны быть выполнены перед иммунопреципитацией; в связи с этим решения для подготовки библиотеки в одной пробирке в данном случае не подойдут;

4) для выделения ДНК после иммунопреципитации рекомендуется использовать набор IPure v2 (C03010014);

5) выполнить амплификацию библиотеки после выделения ДНК в соответствии со стандартным протоколом выбранного набора.

Данную стратегию применяли ученые из Германии, чтобы оценить возможность использования сигналов метилирования во внеклеточной ДНК (вкДНК) больных раком в качестве биомаркеров для минимально инвазивного обнаружения опухолей. Они провели полногеномное профилирование 5-mC в плазме пациентов с метастатическим немелкоклеточным раком легкого, получающих терапию ингибитором ALK-тирозинкиназы. По результатам они разработали стратегию для выявления ALK-специфических изменений паттернов метилирования вкДНК и продемонстрировали пригодность идентифицированных маркеров для обнаружения рака, прогнозирования и мониторинга успешности терапии.

Набор hMeDIP (C02010031) предназначен для захвата и иммунопреципитации гидроксиметилированной ДНК из образцов фрагментированной геномной ДНК. Он содержит высокоспецифичное моноклональное антитело против 5-гидроксиметилцитозина (5-hmC). В состав набора входят контрольная ДНК (гидроксиметилированный ген Sfi1 мыши), специфичные праймеры для оценки эффективности анализа и модуль для очистки ДНК после преципитации. Профилирование гидроксиметилирования с помощью набора hMeDIP выполняется быстро, надежно и высокоспецифично благодаря проведению всего протокола в одной пробирке и использованию магнитных шариков.

Американские ученые использовали этот метод для секвенирования (5hmCDIP-seq) в дополнение к WGBS при изучении изменений метилирования ДНК, вызванных повреждениями в регенеративных и нерегенеративных областях ЦНС шпорцевой лягушки Xenopus laevis. ДНК регенеративного заднего мозга головастика и глаза лягушки была менее метилирована, чем ДНК нерегенеративного заднего мозга лягушки. Однако, вопреки ожиданиям, при аксотомии метилирование ДНК в регенеративной ЦНС увеличивалось и способствовало успешной регенерации аксонов. При этом изменения гидроксиметилирования ДНК, инициированным повреждением, отличались от изменений метилирования CpG во время регенерации зрительного аксона.

4. Метилсвязывающий белок — альтернативный способ обнаружения метилированной ДНК

Технология с использованием метилсвязывающего домена (MBD) человеческого белка MeCP2 также позволяет специфично захватить и очистить ДНК, содержащую метилированные CpG. В ней используется химерный белок H6-GST-MBD, который обладает очень высоким сродством к метилированной ДНК. Этот белок состоит из метилсвязывающего домена (MBD) белка MeCP2 в качестве С-конца, пришитого к глутатион-S-трансферазе (GST), имеющей His₆-тег на N-конце. В пробирке эта конструкция захватывается магнитными шариками, покрытыми глутатионом.

 Протокол с использованием MBD-технологии. Credit: Diagenode

Эта технология реализована в наборе MethylCap (C02020010). Перед анализом ДНК сначала экстрагируют и расщепляют до фрагментов длиной около 400 н.п. с помощью ультразвукового прибора, например, Bioruptor. Для дальнейшей работы необходим как минимум 1 мг ДНК в объеме до 20 мкл. После фрагментирования проводят захват метилированной ДНК белком H6-GST-MBD, а их комплекс, в свою очередь, подбирается магнитными шариками. Далее следуют этапы промывки и элюции. Весь протокол можно провести в течение дня. Подготовленная таким образом метилированная ДНК подходит для проведения qPCR или NGS путем объединения с наборами для подготовки библиотек (например, MicroPlex Library Preparation Kit v3, C05010001).

К преимуществам данного набора можно отнести то, что он не требует модификации ДНК и позволяет провести дифференциальное фракционирование метилированной ДНК. С помощью разных буферов для элюции можно получить три фракции ДНК с различной плотностью CpG.

Гроувс Диксон и Михаил Матц из Техасского университета сравнили разные методы анализа метилирования ДНК у коралловых полипов Acropora millepora. Исследования метилирования ДНК кораллов может улучшить прогнозирование состояния морских экосистем и помочь их сохранить. Однако стандартный метод — WGBS — в настоящее время слишком дорог для масштабного применения. Исследователи сравнили подход WGBS с технологией на основе MBD (MBD-seq) и методом mdRAD - секвенированием ДНК, ассоциированным с сайтами рестрикции, зависимыми от метилирования. Они пришли к выводу, что MBD-seq и mdRAD — надежные и экономически эффективные альтернативы WGBS.

 Acropora millepora. Credit: 123rf.com

Итак, методы анализа паттернов метилирования ДНК имеют множество применений в разных областях: криминалистика, диагностика и оценка терапии рака, экология. Созданы удобные и надежные коммерческие наборы для решения самых разных научных задач. Все перечисленные методические решения могут быть как проведены вручную, так и автоматизированы с помощью станций пробоподготовки (например, IP-Star Compact или IP-Star). Это дает возможность проводить работу на самом высоком научном уровне и получать воспроизводимые и достоверные результаты.

5. Гайд по подбору реагентов для вашего эксперимента

Линейка товаров для анализа метилирования ДНК от Diagenode поставляется в Россию и СНГ компанией SkyGen.

Перейти в каталог

Оформить заказ:

✉️ sales@skygen.com

☎️ 8 800 775 04 19

Реклама
Рекламодатель ООО "Скайджин" 
Токен - LdtCKgoSH