Нобелевская неделя 2021. Дэвид Джулиус: «Маленькие биофизические машины, работающие как молекулярные термометры»

«Меня всегда завораживало то, что изучение природных лекарственных средств — это своего рода связующее звено между поведением человека, химией и нейрофизиологией». Лекция лауреата Нобелевской премии по физиологии или медицине 2021 года. 07.12.2021

Credit:

Скриншот канала Нобелевского комитета

Дэвид Джулиус родился в Нью-Йорке в 1955 году и в настоящее время является профессором в Университете Калифорнии в Сан-Франциско. В этом году ему совместно с Ардемом Патапутяном была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине «за открытия рецепторов температуры и осязания». Он назвал свою лекцию «От перца к перечной мяте: представления о термочувствительности и боли».

По словам Джулиуса, многие результаты, полученные им за последние годы, были направлены на понимание боли и ее механизмов. Из пяти чувств соматосенсорика, именуемая в разговорной речи осязанием, и болевые ощущения — вероятно, самое важное для нашего выживания и благополучия. Боль предупреждает нас о том, что наше тело повреждено или вскоре получит повреждения, и запускает защитные рефлексы. Люди, у которых эта система выведена из строя из-за генетических мутаций или заболеваний, подвергаются высокому риску. Но зачастую боль становится постоянной и изнурительной, и тогда она превращается во врага, с котором нужно бороться. Цель исследований боли, отметил Джулиус, — «понять механизм переключения между острой и хронической болью, чтобы в конце концов суметь ее предотвратить или повернуть вспять. Еще одна задача в области исследований боли — научиться различать болевые синдромы, понять, в чем заключаются их различия на клеточном и молекулярном уровне».

Джулиус кратко рассмотрел путь передачи боли: как и другие сенсорные системы, он включает восприятие стимулов, осуществляемое окончаниями периферических нервных волокон, которые затем передают полученную информацию в центральную нервную систему, сначала в спинной мозг, затем в головной, где стимул и распознается как вредный или болевой.

В лаборатории Джулиуса основное внимание уделялось тому, что происходит на периферии, в окончаниях первичных афферентных нейронов. Это очень интересные клетки, которые распознают широкий спектр стимулов — изменения температуры и давления, ядовитые химические вещества из окружающей среды, а также вещества, высвобождающиеся в ответ на повреждения тканей. Что особенно удивительно, эти клетки имеют рецепторы для каждого компонента «воспалительного супа», повышающие их чувствительность. «Цель моей лаборатории, как и многих других в этой области, — понять, как эти стимулы действуют на окончания нейрона… чтобы регулировать его возбудимость в нормальных условиях и при повреждении», — сказал Джулиус.

Стоя на плечах гигантов: народная медицина и ноцицепция

В самом начале этих исследований, около 25 лет назад, генетические методы и инструменты выявления молекул и механизмов, задействованных в метаболических путях, были не так развиты, как сейчас. Поэтому Джулиус и его коллеги, чтобы обнаружить механизмы, участвующие в восприятии боли, обратились к природным соединениям и даже к народной медицине: «Я иногда называю это фармакологией, отточенной эволюцией. Меня всегда завораживало то, что изучение природных лекарственных средств — это своего рода связующее звено между поведением человека, химией и нейрофизиологией».

Джулиус привел несколько примеров использования природных соединений для открытий в области физиологии: Соломон Снайдер и открытие опиоидных рецепторов, сэр Джон Вейн и исследование роли аспирина — производного салициловой кислоты, содержащейся в ивовой коре, Рафаэль Мешулам и открытие эндогенных каннабиноидов после выявления психоактивных веществ в марихуане. Джулиус отметил, что это очень мощный подход; опиоидные анальгетики и нестероидные противовоспалительные препараты — это две основные группы анальгетиков, которые используются до сих пор.

Однако вместо того чтобы изучать, как природные вещества оказывают болеутоляющее действие, Джулиус и его коллеги решили взглянуть на обратную сторону вопроса и разобраться, как другие вещества вызывают боль. Очевидным выбором были капсаицин, придающий остроту перцу, ментол, содержащийся в листьях мяты, изотиоцианаты и тиосульфинаты, отвечающие за остроту многих растений и приправ, таких как лук, чеснок, горчица и васаби.

Джулиус упомянул две исследовательские группы, которые значительно повлияли на его подход к этому вопросу. Николас и Аурелия Янско с коллегами впервые использовали капсаицин в качестве стимула для афферентных нейронов и сделали важные наблюдения по поводу их роли в восприятии боли и влияния капсаицина на биохимические пути, участвующие также в терморегуляции. Ингве Зоттерман и Герберт Хенсел продемонстрировали, что влияние ментола на нервные окончания в кошачьем языке может подавляться нагреванием и усиливаться охлаждением. Обе работы указывали на то, что рассмотренные вещества избирательно воздействуют на окончания соматосенсорных нервных волокон и что их изучение позволит выявить молекулярные механизмы восприятия боли — а также, возможно, температуры.

В последующие годы все усилия группы были направлены на то, чтобы понять, как работает капсаицин. Так, в 1990-е годы ученые из Института медицинских исследований Сандоз Университетского колледжа Лондона задались вопросом о работе капсаицина с точки зрения биофизики. Основываясь на данных, полученных методом пэтч-кламп, они предположили, что капсаицин повышает проницаемость мембран чувствительных нейронов для одно- и двухвалентных катионов. Предполагалось, что капсаицин воздействует на канал или рецептор, сопряженный с ионным каналом, и его селективное действие основывается на экспрессии рецептора на поверхности клетки. В то же время существовала гипотеза о том, что действие капсаицина не избирательно и обусловлено тем, что он встраивается в клеточную мембрану и формирует подобие поры для ионов. Все эти предположения сводились к вопросам, которые первым задал еще Янско: воздействуют ли естественные раздражители на специфические рецепторы чувствительного нейрона, какова молекулярная природа таких рецепторов и можно ли использовать эти рецепторы для выделения подтипов нейронов, в частности, для определения ноцицепторов (рецепторов боли).

В поисках Святого Грааля

«Главным вопросом было, в чем заключается внутреннее физиологическое значение этих молекул, если они существуют, — сказал Джулиус. — Очевидно, что такие карательные рецепторы нужны нам не для того, чтобы распробовать все многообразие кулинарных специй. Какова их роль в нормальных физиологических условиях? Так было обозначено то, что мы часто называем Святым Граалем молекулярных исследований боли: поиск капсаицинового рецептора».

Грааль был обнаружен, когда Майкл Катерина присоединился к группе Джулиуса и взялся за клонирование гена, который, как предполагалось, кодировал рецептор капсаицина. Его подход был прост: он брал соматосенсорные нейроны мышей или крыс, создавал библиотеки комплементарных ДНК и помещал их в невозбудимые клетки — фибробласты. Идея заключалась в том, что если капсаициновый рецептор увеличивает внутриклеточную концентрацию кальция, то его можно зарегистрировать при помощи кальций-чувствительных красителей. Таким образом, после введения в клетку кДНК и красителя исследователи обрабатывали культуры капсаицином и искали светящиеся клетки — в них, как предполагалось, находилась кДНК гена, продукт которого делает клетку чувствительной к капсаицину.

Катерина справился с задачей и вместе с коллегами определил, что этот ген в самом деле кодировал ионный канал, проницаемый для одно- и двухвалентных катионов. Также он показал, что этот рецептор чувствителен к количеству капсаицина в перце: его ответ пропорционален остроте. Так был обнаружен рецептор, с помощью которого определяется жгучесть перцев по знаменитой шкале Сковилла.

Года через два к команде присоединился Дэвид Маккеми, который тем же способом выделил рецептор, чувствительный к ментолу. Оказалось, что оба рецептора принадлежат к одному и тому же семейству TRP-каналов: TRPM8 — ментоловый, TRPV1 — капсаициновый. Более того, к нему же относился рецептор к веществам из васаби, лука и чеснока — TRPA1. Это указывало на важную роль TRP-каналов в целом и в соматосенсорике в частности.

Молекулярные термометры

Какова природная роль этих каналов в физиологии? Ответ на этот вопрос был получен, когда группа под руководством Джулиуса выяснила, что фибробласты с внесенным в них геном рецептора приобрели термочувствительность. Порогом активации большинства капсаициновых каналов была температура 43° С, при которой тепло становится обжигающим. Ментоловые рецепторы, напротив, активировались холодом: эти каналы открывались, когда температура падала ниже 25° С. Таким образом, в норме эти каналы служили для восприятия температуры, а капсаицин и ментол понижали пороги их активации, по сути, работая как психофизиологический эквивалент нагревания и охлаждения.

Доказательство термочувствительности получила Эрху Као в лаборатории Джулиуса: она определила изменения проводимости очищенного белка TRPV1, встроенного в искусственную мембрану, в зависимости от температуры. Полученные результаты в точности совпали с такими же измерениями для трансфицированных клеток и афферентных нейронов. «Так было подтверждено изящное предположение о том, что сами эти белки — маленькие биофизические машины, работающие как молекулярные термометры», — сказал Джулиус.

А как насчет функции рецепторов in vivo? В качестве иллюстрации Джулиус привел пример эксперимента, поставленного в его лаборатории Дианой Батиста, Яном Сименсом и Свеном Йотом. Мышь с нокаутированным геном ментолового рецептора не могла различить платформы с температурами 20 и 30° С, в то время как контрольная мышь предпочитала оставаться на теплой платформе. Нокаутированная мышь не распознавала холодную платформу, пока ее не охлаждали до действительно болезненной температуры. Так удалось подтвердить, что эти рецепторы необходимы для восприятия температуры in vivo, а камеры, в которых проводился эксперимент, сейчас передали в музей Нобелевской премии.

Затем были выделены два типа афферентных нейронов, несущих рецепторы только одного типа: к теплу или к холоду. Иначе говоря, получаемые сигналы обрабатывались разными клетками с самого начала, а объединялись в общее восприятие температуры на более высоком уровне. С тех пор был открыт целый ряд TRP-каналов, чувствительных к разным температурам. Их распределение по клеткам пока еще не изучено до конца, но разделение каналов TRPM8 и TRPV1 по разным волокнам, возможно, задает определенную схему для восприятия.

Завершая рассказ о роли рецепторов в норме, Джулиус упомянул работы Елены Грачёвой и Хулио Кордеро-Моралеса на животных, чувствительных к ИК-излучениям, в частности, на летучих мышах-вампирах. Спящую жертву они находят по тепловому излучению, поэтому их нос пронизан соматосенсорными нервными волокнами, чрезвычайно чувствительными к температуре. Оказалось, что у летучих мышей две формы канала TRPV1, одна из них аналогична человеческой, а другая имеет более низкий температурный порог активации и используется для поиска добычи. Еще один пример подобной эволюционной адаптации — изменения активационного порога каналов у животных с базальной температурой тела, отличной от человеческой, — обнаружил Бен Майерс в лаборатории Джулиуса.

От фундаментальных исследований к потенциальным лекарствам

Понимание принципов работы рецепторов в норме, безусловно, интересно, но с точки зрения медицины важно понимать, как соматосенсорная нервная система адаптируется к повреждениям. При солнечном ожоге или вывихе сустава чувствительность к температуре и давлению значительно усиливается, и эта гиперчувствительность лежит в основе многих хронических и стойких болевых синдромов. Основная цель, стоящая перед лабораторией Джулиуса и другими исследователями ноцицепторов, — понять, какие изменения в химическом и физиологическом микроокружении приводят к гиперчувствительности и какие изменения в афферентных волокнах вызывают долговременные нарушения путей восприятия боли.

Оказалось, что на TRPV1 воздействует множество компонентов «воспалительного супа», а сам рецептор представляет собой сложный механизм для полимодальной сигнализации. Прямые аллостерические модуляторы его активности, например протоны и эндогенные липиды, взаимодействуют с сайтами самого TRPV1, а непрямые, такие как брадикинин и внеклеточные нуклеотиды, — с собственными рецепторами, которые запускают пути вторичной сигнализации, влияющие на чувствительность канала. Оба типа модуляторов понижают порог активации канала до базальной температуры тела. Это позволило предположить, что TRP-каналы могут быть терапевтическими мишенями, в особенности при воспалении.

За годы исследований было описано несколько антагонистов TRPV1: у добровольцев, принимавших эти препараты, порог чувствительности к высоким температурам вырос на 4-5° С. Также добровольцы отмечали гипотермию, что лишний раз подтвердило роль TRPV1 в восприятии тепла.

Однако для разработки болеутоляющих препаратов важно избавиться от хронической боли, не утратив защитную функцию острых болевых вспышек. У обнаруженных антагонистов TRPV1 оказалось слишком много побочных эффектов. Джулиус предполагает, что стоит искать более таргетные препараты, которые будут вмешиваться во взаимодействия компонентов «воспалительного супа» и рецепторов, не меняя их основную функцию.

С разрешением до атома

Необходимо было определить структуру каналов, чтобы выявить потенциальные сайты для более тонкой регуляции их чувствительности. 3D-структуру TRPV1 получили при помощи криоэлектронной микроскопии. «Это действительно был еще один момент прозрения, мы стояли на пороге того, что сейчас называется “революцией разрешения” в криоэлектронной микроскопии, — стало возможным получить структуру мембранных белков с атомным разрешением». 

Удалось не только описать молекулярное строение, но и получить ряд промежуточных конформаций TRPV1, соответствующих различным степеням проницаемости канала. Он представляет собой тетрамер, отчасти напоминающий потенциал-зависимые калиевые каналы; также у него был обнаружен селективный фильтр и воротный механизм, расположенный ближе к цитоплазматической стороне. Такая структура, вероятно, лежит в основе полимодальной работы канала, обеспечивающей взаимодействие с широким спектром лигандов: протоны оказывают влияние на сайты в области селективного фильтра, а биоактивные липиды, наоборот, воздействуют на воротный механизм.

Лучшее понимание структуры канала позволит более эффективно разрабатывать лекарства: на примере простейшего связывания протона с рецептором можно понять, какие межмолекулярные взаимодействия нарушаются в его присутствии, найти способы обратить этот эффект и нивелировать снижение порога активации канала.

Джулиус завершил свою лекцию благодарностями всем членам своей лаборатории, бывшим и действующим, а также коллабораторам, наставникам и родным.

Добавить в избранное

Вам будет интересно