Анализ единичных клеток в России: V Международная научно-практическая Школа «Анализ отдельных клеток» (ASCA 2023 Workshop) и компания SkyGen

В апреле 2023 года, когда портал PCR.NEWS готовил серию интервью к 70-летию расшифровки структуры ДНК, мы спрашивали у российских ученых, что их больше всего поражает в современных методах работы с нуклеиновыми кислотами. Виктор Татарский, заведующим лабораторией молекулярной онкобиологии Института биологии гена РАН, сказал, что «РНК- или ДНК-секвенирование в одиночных клетках для меня до сих пор фантастическая вещь». Евгений Денисов, заведующий лабораторией биологии опухолевой прогрессии НИИ онкологии Томского НИМЦ, назвал подходы к анализу нуклеотидных последовательностей на уровне единичных клеток «гениально простой идей».

Технология анализа единичных клеток ворвалась в биологическую науку несколько лет назад и уже прочно утвердилась в ней. Сегодня в таких областях, как молекулярная биология, геномика, постгеномика, без нее не обойтись. Она завоевывает также эмбриологию и морфологию. Теперь у этой технологии есть вариации, которые позволяют использовать различные материалы и модифицировать протоколы для точности и удобства пользования. Не использовать эту технологию вовсе — значит отстать от мировой науки.

С чего все начиналось и новые технологии

У истоков работы с единичными клетками в России стояли томские ученые, которые организовали Школу молодых ученых. В этом году прошла V Международная научно-практическая Школа «Анализ отдельных клеток» (ASCA 2023 Workshop). За время ее существования название Школы менялось несколько раз, но суть оставалась неизменной — она является источником передовых знаний о технологии работы с единичными клетками. В рамках Школы проходит полноценный «мокрый» практикум. Никаких симуляций, никаких моделирований, только реальные образцы и реальные реактивы, которые и предоставляет SkyGen. Работа Школы не прерывалась и во время пандемии, учебный процесс проходил онлайн и поддерживался компанией SkyGen.

 V Международная научно-практическая Школа «Анализ отдельных клеток» (ASCA 2023 Workshop)

В первые годы Школа финансировалась за счет мегагранта Российского научного фонда. Но в прошлом году он закончился, и теперь финансирование Школы идет в основном со стороны компаний-партнеров. Именно они позволяют сохранить доступность мероприятия, так как у Школы нет регистрационного взноса. Очень важно предоставлять доступ к новейшим технологиям как можно большему числу молодых ученых, ведь без этого невозможно двигать вперед российскую науку. 

Изначально технологии работы с единичными клетками базировались на продуктах компании 10x Genomics. И российские ученые очень хотели поработать с этой технологией. Освоение новых методов — это всегда определенный риск, но специалисты Томского НИМЦ не прогадали: это передовые технологии, которые к тому же постоянно развиваются. SkyGen — официальный дистрибьютор компании 10x Genomics.

 Анастасия Щеголева, м.н.с. лаборатории биологии опухолевой прогрессии НИИ онкологии ТНИМЦ РАН, стажер-исследователь лаборатории биологии единичных клеток РУДН

Не так давно появилось новое решение Chromium Single Cell Gene Expression Flex, которое изменят привычные возможности исследований единичных клеток. Данный набор реагентов позволяет получать данные из свежих, замороженных и фиксированных образцов — даже из FFPE. Лаборатория теперь может собрать необходимое количество образцов для эксперимента, а также транспортировать их при необходимости.

Также снизилось рекомендованное количество ридов на одну клетку, что является экономически выгодным решением. Возможность мультиплексировать образцы — ещё один ход, помогающий подготовить большее количество образцов за один запуск.

Набор Chromium Gene Expression Flex совместим с прибором Chromium X, который недавно приобрел Российский университет дружбы народов (РУДН). На базе РУДН в ноябре также пройдет школа по работе с единичными клетками ASCA Moscow Workshop 2023. 

Появились и более экзотичные протоколы. Если раньше предполагалось, что сначала исследователи диссоциируют клетки и получают ядра, а потом их фиксируют, то теперь можно зафиксировать ткань, а потом уже диссоциировать ее до отдельных клеток, что очень удобно при определенных условиях. Получать отдельные клетки можно и из FFPE-образцов.

 Практикум по пространственной транскриптомике (Visium, 10X Genomics). Изображение слева получено с помощью прибора Visium CytAssist; справа — фиксирование предметных стекол с образцами в приборе Visium CytAssist

С помощью компании SkyGen в Томске был установлен первый в России прибор Visium CytAssist. Новая технология позволяет совмещать приемы гистологии и геномики. После стандартного гистологического окрашивания и визуализации лигированные зонды можно перенести с обычного предметного стекла на слайды Visium для изучения пространственной транскриптомики клеток.

В совместном практикуме по пространственной транскриптомике приняли участие молодые ученые из разных городов России.

 В сравнении с ручным проведением протокола, Visium CytAssist:

— упрощает рабочий процесс;

— подойдет для лабораторий с небольшим опытом работы со срезами, так как благодаря нему не требуется кропотливое выравнивание среза ткани относительно зоны захвата;

— на приборе можно использовать слайды с увеличенной зоной захвата (11х11 мм, для ручного протокола доступны только слайды 6,5х6,5 мм), позволяющие анализировать бо́льшие участки;

— наличие встроенной камеры в приборе позволяет сразу же получить изображение после переноса на слайд и оценить результат.

Поскольку анализ единичных клеток очень важен, на сегодняшний день на российском рынке присутствует не только 10x Genomics, но и SeekGene.

 Сотрудники лаборатории, участники практикума и представители SkyGen Татьяна Буканова и Тимур Ягудин FAS

Расширение технологии анализа единичных клеток

Компания SeekGene была основана в 2018 году и базируется в Пекине (Китай). Она продвигает технологии анализа единичных клеток в онкологии и иммунологии, а также разработке лекарственных препаратов. Компания получила более 40 патентов на изобретения и 10 авторских прав на программное обеспечение. В этом году компания SeekGene впервые поучаствовала в V Международной научно-практической Школе «Анализ отдельных клеток».

 Запуск прибора SeekOne сотрудниками Томского НИМЦ и FAS компании SeekGene
Сотрудники лаборатории опухолевой прогрессии НИИ онкологии ТНИМЦ РАН и лаборатории биологии единичных клеток РУДН:  
Евгений Денисов, д.б.н., зав. лабораторией биологии опухолевой прогрессии НИИ онкологии ТНИМЦ РАН, зав. лабораторией биологии единичных клеток РУДН.
Татьяна Геращенко, к.м.н., н.с. лаборатории биологии опухолевой прогрессии НИИ онкологии ТНИМЦ РАН, н.с. лаборатории биологии единичных клеток РУДН.
Максим Меняло, к.м.н., н.с. лаборатории биологии опухолевой прогрессии НИИ онкологии ТНИМЦ РАН, н.с. лаборатории биологии единичных клеток РУДН
Анастасия Щеголева, м.н.с. лаборатории биологии опухолевой прогрессии НИИ онкологии ТНИМЦ РАН, стажер-исследователь лаборатории биологии единичных клеток РУДН.
Егор Волчков, врач-гематолог отделения онкогематологии, научный сотрудник отдела изучения лимфом ФГБУ НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева МЗ РФ, научный сотрудник лаборатории биологии единичных клеток НИИ молекулярной и клеточной медицины РУДН
Технические специалисты SeekGene: Peng Tiankui, Application Scientist.

У SeekGene свой прибор для работы с единичными клетками — Seek One® DD. От продукции 10x Genomics его отличает ряд характеристик:

—  чип можно использовать повторно, защищая неиспользуемые каналы специальным чипом;

— прибор оснащен датчиком контроля температуры,

— прибор прост в управлении;

— есть протокол полнотранскриптомного секвенирования единичных клеток, которого нет у 10x Genomics.

Этот протокол позволяет анализировать параметры, недоступные 3’ или 5’-секвенированию транскриптомов. Например, с его помощью можно изучать РНК без полиА-хвоста, такие как мРНК, выявлять однонуклеотидные замены, фьюжены, сплайс-варианты и инделы.

Первый запуск такого прибора в России состоялся в августе 2023 года в лаборатории Евгения Владимировича Денисова Томского НИМЦ. Ожидаются результаты сравнения работы двух платформ.

Новые исследования ученых

В рамках круглого стола Школы ученые докладывали о результатах работы, выполненной с помощью анализа единичных клеток.

Сергей Попов, кандидат медицинских наук, руководитель группы генетики многофакторных эндокринных заболеваний из НМИЦ эндокринологии, прочитал доклад «Применение методов транскриптомного анализа единичных клеток в исследовании различных типов онкологических заболеваний эндокринной системы». Он представил предварительные данные, полученные в рамках глобального проекта «Клеточный атлас эндокринных желез на основе технологии Single Cell». В первую очередь это гипофиз, надпочечники и щитовидная железа.

Сначала ученые создали пять протоколов для работы с единичными клетками. С их помощью были исследованы клетки аденом гипофиза. Пролактиномы — это наиболее распространенные гормонально активные аденомы гипофиза. Называются они по вырабатываемому гормону пролактину. Основной метод их лечения — это агонисты дофамина. Но около 20% пациентов с пролактиномами или неудовлетворительно реагируют на высокие дозы агонистов, или являются резистентными. С помощью анализа единичных клеток ученые хотели узнать, как лечить таких пациентов.

На первом этапе авторы исследования провели оценку дифференциальной экспрессии генов, характерных для чувствительного и резистентного пролактина, и выявили генные сигнатуры, определяющие статус чувствительности и агрессивности роста. Работа продолжается.

 Практикум по биоинформатике

Дарья Жигалина, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории геномики орфанных болезней НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, прочитала доклад под названием «Эмбриоидные тельца как модель раннего эмбриогенеза человека». Знания о технологии работы с единичными клетками ее команда получила непосредственно на предыдущей Школе.

Целью работы было проверить, можно ли использовать эмбриоидные тельца в качестве модели для изучения раннего эмбрионального развития. Дело в том, что эмбриональное развитие человека изучено достаточно хорошо только до определенного этапа — до момента имплантации в матку. После этого ученым в основном приходится иметь дело с абортивным материалом, транскрипция которого отличается от живого эмбриона.

Многое можно понять по модельным животным, но транскриптом, например, мыши, значительно отличается от транскриптома человека. Эмбрионы человека теоретически можно культивировать и после того этапа, на котором эксперименты прерываются в настоящее время, но такие эксперименты граничат с нарушением биоэтических норм. Поэтому ученые ищут модельные системы, максимально приближенные к объекту. Такой моделью могут стать эмбриоидные тельца, клетки которых также образуют три зародышевых листка. Но насколько такие тельца адекватно отражают процессы, происходящие в эмбрионах? Это можно понять с помощью анализа единичных клеток.

 Татьяна Буканова, продакт-менеджер по направлению NGS и молекулярная биология. Доклад на круглом столе «Все для вашего single-sell эксперимента и немного больше». 

Сначала методами цитохимии авторы исследования подтвердили наличие трех зародышевых листков. Потом получили суспензию из эмбриоидных телец и проанализировали с помощью технологии 10x Genomics. После проверки качества в анализ вошли 1964 клетки. Эти клетки разделялись на несколько групп, такие как, например, клетки будущей нервной системы эмбриона. Сложность анализа состоит еще и в том, что эти клетки быстро делятся и дифференцируются, так что имеют «переходный» профиль экспрессии. В клетках было найдено большое количество несплайсированных мРНК, что, вероятнее всего, также свидетельствуют об активном делении.

Клетки нервного гребня и края нервной пластинки оказались очень похожими по профилю экспрессии, но все же образовывали отдельные кластеры. Латеральная мезодерма не похожа ни на один из других кластеров, только на мезенхимальные стволовые клетки, из которых она и формируется. Нервные клетки преобладали в тельцах, как это происходит и в настоящих эмбрионах, ведь сначала формируется нервная система, а потом — остальные ткани.

Дарья Жигалина заключает, что этот опыт позволил подтвердить пригодность эмбриоидных телец как модели эмбрионов. Эта модель обладает большими преимуществами — ее получают из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, что проще, чем получение эмбриональных стволовых клеток из внутренней клеточной массы эмбрионов. Также открываются широкие перспективы в области редактирования геномов этих моделей.

На V Международной научно-практической Школе «Анализ отдельных клеток» (ASCA 2023 Workshop) в очередной раз собрались молодые специалисты, чтобы научиться работать с технологиями анализа единичных клеток 10X и SeekGene и обсудить, какие результаты уже достигнуты. Доклады очно и онлайн представили ученые из России, США, Японии, Германии, Великобритании, Австрии, Южной Кореи и Китая.

Компания SkyGen может привезти и установить оборудование компаний 10Х и SeekGene, и оказать вам научную и техническую поддержку.  

«Мы постоянно расширяем свое портфолио за счет проверенных брендов и стараемся делать новейшие технологии доступными для всех. Если вы планируете анализ единичных клеток и хотели бы сравнить платформы, Skygen готов предоставить вам приборы под ваши эксперименты», — говорит Татьяна Буканова, продакт-менеджер по направлению NGS и молекулярная биология.

Напишите нам свой запрос на info@skygen.com

Реклама. Рекламодатель ООО «СкайДжин»

Токен LdtCKAGNT