29.08.2022

Thermo уходит, секвенирование по Сэнгеру остается: реагенты NimaGen для приборов Applied Biosystems

В последние месяцы российские пользователи генетических анализаторов Applied Biosystems столкнулись с невозможностью приобрести оригинальные реагенты для секвенирования и полимеры для капиллярного электрофореза. Компания SkyGen предлагает альтернативу: продукты компании NimaGen. Они полностью совместимы с приборами Applied Biosystems и уже завоевали любовь российских лабораторий.

Credit:

SkyGen

Технологии в молекулярной биологии стремительно развиваются. NGS и нанопоровое секвенирование приобрели огромную популярность, однако секвенирование по Сэнгеру остается золотым стандартом. Его используют для оценки эффективности редактирования генома, валидации результатов NGS, анализа ПЦР-фрагментов, плазмид и т. д. Метод основан на встраивании в растущую на матрице цепь ДНК модифицированных нуклеотидов, прерывающих (терминирующих) реакцию. Сначала проводится ПЦР-амплификация мишеней, затем секвенирующая реакция с терминирующими нуклеотидами, в результате которой получается смесь фрагментов ДНК разных длин. Эта смесь разгоняется с помощью электрофореза, и по сигналам от нуклеотидов-терминаторов восстанавливается последовательность ДНК-мишени.

Этапы секвенирования по Сэнгеру. Credit: SkyGen

Современные приборы объединяют блоки для секвенирующей реакции и анализа фрагментов. В качестве терминаторов используются дидезоксинуклеотиды с флуоресцентными метками. После секвенирующей реакции проходит аналитический капиллярный электрофорез. Флуоресцентный сигнал, уникальный для каждого нуклеотида, считывается датчиком, обрабатывается программой и выдается пользователю в виде последовательности букв.

Больших успехов в области секвенирования по Сэнгеру добилась компания Applied Biosystems (приобретена компанией Thermo Fisher Scientific в 2016 году). Ее генетические анализаторы установлены в лабораториях по всему миру, в том числе в России. В линейке ABI есть приборы с разным количеством и длиной капилляров, рассчитанные на различные задачи и лаборатории с различной производительностью.

Капилляры, в которых проходит разделение фрагментов ДНК, заполнены полимером, причем тип полимера зависит от цели секвенирования. Эти капилляры требуют обслуживания: их нужно периодически очищать и заполнять полимером заново. Однако несколько месяцев назад компания Thermo Fisher ушла с российского рынка, что затруднило закупку и доставку оригинальных полимеров и растворов для очистки. То же касается и реагентов для секвенирования: меченых дидезоксинуклеотидов, наборов для подготовки ДНК к анализу и очистки продуктов секвенирующей реакции. Решение есть у компании SkyGen: в ее портфолио представлены товары нидерландской компании NimaGen, совместимые с секвенаторами Applied Biosystems.

В каталоге NimaGen можно найти реагенты для всех этапов секвенирования по Сэнгеру. Российские исследователи активно пользуются продукцией NimaGen и делятся впечатлениями. Так, сотрудник Института экологии растений и животных УрО РАН Петр Сибиряков секвенирует митохондриальные геномы животных. Для капиллярного электрофореза его лаборатория использует приборы ABIPrism 3130, ABIPrism 3500 (Applied Biosystems) и Нанофор 05 («Синтол»). «Из продукции NimaGen в настоящее время мы используем наборы BrilliantDye™ Terminator v 3.1 для проведения секвенирующей реакции и D-Pure™ для очистки продуктов секвенирующей реакции. На всех трех приборах химия показала хороший выход как в плане интенсивности сигнала, так и в длине прочтений (700 пар нуклеотидов читаются, если они есть). В целом нет принципиальных отличий от химии Thermo, — говорит Петр. — Отдельно стоит отметить, что ставили эксперимент по смешиванию BrilliantDye 3.1 и BigDye 3.1 (аналогичные продукты от компаний Nimagen и Thermo Fisher — PCR.NEWS). В результате выяснили, что можно спокойно смешать обе химии в одну пробирку и ставить реакцию по стандартному протоколу. Также можно использовать буфер от BigDye с премиксом от BrilliantDye, и в обратную сторону. Во всех случаях получаются хорошие сиквенсы без ощутимой потери в качестве».

Мария Полежаева, которая работает в том же институте, тоже подчеркивает качество набора BrilliantDye: «Мы пользовались наборами BrightDye и пришедшим ему на смену BrilliantDye — довольны этими продуктами. Качество сиквенсов на выходе высокое. Нравится, что наборы долго хранятся на -80°C, можно не переживать, что не успеешь использовать реагенты. Из экономии разводим их даже сильнее, чем по прописи, и все получается. Также нравится набор для очистки ПЦР-продукта ExS-Pure».

Яна Топоркова из ФИЦ «Казанский научный центр Российской академии наук» отмечает популярность реагентов NimaGen: «Берем BrilliantDye 3.1 и сейчас взяли буфер для секвенирования. BrilliantDye 3.1 нас полностью устраивает как аналог BigDye (Thermo). Отличное качество сиквенсов! Сейчас взяли сразу много, так как приходят коллеги и “одалживают” реагенты. Мы постоянно секвенируем, все статьи сделали с использованием NimaGen».

Полимеры для капилляров у NimaGen тоже не хуже полимеров Thermo. Об этом говорит Ксения Комиссарова, сотрудница НИИ гриппа им. Смородинцева: «На данный момент заменили только полимер POP7, все устраивает разницы никакой не заметили. Так как в институте делаются крупные закупки, все еще осталось много реагентов Thermo. Пока есть большой запас, нет необходимости менять другие компоненты. Хорошо, что знаем, что есть надежная замена».

1 1000.jpg