Вирус жаркого лета

Как отличить флавивирусную инфекцию от энтеровирусной? Что нужно для идентификации вируса, который ты видишь впервые в жизни? Можно ли предсказать распространение инфекции, которую разносят комары? Главный научный сотрудник ЦНИИЭ, доктор биологических наук Александр Платонов рассказал PCR.NEWS о первой крупной вспышке лихорадки Западного Нила в России, которая произошла в Волгоградской области в 1999 году.

Коллеги А.Е. Платонова — Л.С. Карань, М.В. Федорова и Ю.Я. Венгеров. Фото предоставлено А.Е. Платоновым.

Лихорадка Западного Нила впервые была обнаружена в Уганде в 1937 году. Возбудитель этой инфекции относится к флавивирусам; его переносят комары. У человека в большинстве случаев она проходит незаметно или с легкими симптомами, но у 10% инфицированных развивается менингоэнцефалит, который может закончиться летальным исходом.

В настоящее время лихорадка Западного Нила входит в группу глобально распространяющихся инфекций. Изначально ее считали инфекцией южных регионов, однако она успешно расширяет свой ареал на север. Летом 2021 года впервые случилась вспышка лихорадки Западного Нила в Москве и Московской области. О расследовании этой вспышки и о том, какую роль в нем сыграли птицы, мы написали прошлой осенью. В руках ученых были все современные молекулярно-диагностические методы. В частности, эпидемиологическую картину восстановили не только по вероятным перемещениям пациентов, но и по результатам филогенетического анализа образцов.

Первая крупная вспышка инфекции в России произошла в 1999 году. Больше всего пострадала Волгоградская область. Тогда в руках ученых не было даже специфических праймеров для классической ПЦР, но это не помешало команде ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора идентифицировать возбудитель за неделю. Мы поговорили с одним из участников, Александром Евгеньевичем Платоновым, о том, как это было.

А.Е. Платонов в кабинете. Фото предоставлено А.Е. Платоновым.

Волгоград

Как все началось? Как вы поняли, что нужно собираться и ехать в Волгоград?

Началось довольно странно. Я занимался менингитами. За ПЦР-диагностику отвечали мои коллеги: придумывали тест-системы, испытывали их. В первую очередь мы занимались бактериальными менингитами — менингококковыми, пневмококковыми и вызванными гемофильной палочкой. Но кроме бактериальных менингитов бывают энтеровирусные, особенно у детей. На первых этапах они довольно похожи на бактериальные, поэтому важно было разработать ПЦР-диагностику. Мы сделали это летом 1999 года, а испытать не успели. В это время в Волгоградской области, где была самая высокая заболеваемость менингококковой инфекцией, сложилась картинка, которая меня удивляла. Я строил графики заболеваемости по субъектам РФ, и везде заболеваемость падала. А в Волгоградской области росла — в 1998 году больше случаев, чем в 1997-м.

В 1999 году я только приехал из Дании, как в шесть утра раздался звонок от коллеги: что-то странное творится в Волгограде. Надо ехать разбираться. Я довольно быстро собрал небольшую рабочую группу: как клиницист поехал профессор Венгеров, с которым я давно сотрудничал, дали мне эксперта из Роспотребнадзора. Она была специалистом по кишечным инфекциям, но мы и подозревали энтеровирус. Поехали за свои, потому что никто в Москве нам командировку не оформил.

Что вы обнаружили на месте?

Обнаружили, что это не похоже на энтеровирусную инфекцию совсем, потому что не было так называемых семейных очагов. Для энтеровирусной инфекции, как и для многих других инфекций с водным механизмом передачи, характерны небольшие кластеры. Например, в семье все «неправильной» воды попили или болеют все ученики в классе. В Волгограде все случаи были единичными, и их уже было много. Мы не планировали оставаться там надолго, потому что особо нечего было там делать, кроме как забрать имеющиеся пробы и отвезти в Москву, чтобы здесь исследовать их методом ПЦР. В Волгограде это было невозможно. Ехали мы туда на поезде, я читал книжку «Инфекционные и паразитарные болезни человека» Б.Л. Черкасского. Она организована как словарь: на каждую инфекционную болезнь дана небольшая главка. И я обнаружил, что волгоградские случаи похожи на лихорадку Сент-Луис, родственную лихорадке Западного Нила. Ее тоже переносят комары. Но в книге было неправильно написано, что лихорадкой Сент-Луис больше болеют пожилые люди, а лихорадкой Западного Нила — дети. В Волгограде больше болели пожилые люди. Неточность заключалась в том, что это зависит от региона. В теплых местах типа Египта, где лихорадка Западного Нила есть всегда, действительно больше болеют дети, потому что взрослые все переболели. А в тех местах, где лихорадка «выстреливает» только иногда, больше болеют пожилые люди. Они более чувствительны, у них ослаблен иммунитет, хотя до сих пор точно не понятно, что именно ослаблено.

Мы не знали этого. Мы собрали пробы, и я думал, что это может быть лихорадка Сент-Луис, потому что так в учебниках написано.

Вы сами отбирали образцы крови, или они уже были отобраны специалистами в Волгограде?

Местные специалисты и до нас собирали, и при нас. Оказалось, что в образцах крови маленькая вирусная нагрузка. Мы этого не знали в тот момент. Через несколько лет выяснили, что нагрузка довольно большая, когда человек только заболел, лежит дома. А в тот момент, когда его уже госпитализировали, нагрузка довольно маленькая, и там трудно что-то найти. (У каждого метода диагностики инфекции есть оптимальное временное окно. В случае с лихорадкой Западного Нила содержание нуклеиновых кислот вируса в крови максимально в первые дни инфекции. В это время вирус можно засечь методом ПЦР. Затем уровень РНК в крови падает ниже порога чувствительности ПЦР-диагностики. Обнаружить его этим методом становится невозможно — PCR.NEWS.) Здесь нам помогло то, что дополнительно были взяты и отвезены в Москву образцы головного мозга у 12 человек, погибших от энцефалита.

Москва

Как вы выяснили, что это именно лихорадка Западного Нила?

Мы срочно собрались, стали делать тест-систему. Синтезировали праймеры. Мы не знали, какой именно флавивирус ищем, поэтому праймеры были не очень хорошие, но зато они ловили все или почти все флавивирусы. Поскольку в тканях головного мозга больных вируса было много, мы его немедленно поймали, немедленно секвенировали и поняли, что это все же лихорадка Западного Нила. Сделали более чувствительные праймеры уже на лихорадку Западного Нила. Совершенно параллельно шли американцы. У них буквально в то же самое время — в последних числах июля — шло заболевание, максимума достигли к 4–10 сентября, и они тоже не знали, что это. Приблизительно такими же методами они добрались до понимания, что это лихорадка Западного Нила. Для них это было много удивительнее, потому что этой лихорадки в Америке не было никогда, и до сих пор не знают, как она там появилась. То ли какая-то больная птица, перелетела через Атлантику, то ли какой-то человек, которого так и не нашли, приехал и был настолько заражен, что с него мог начаться раскручиваться цикл заражения комаров и птиц. Им было в этом смысле немного труднее.

Сколько времени заняло расследование?

Очень мало, неделю, наверное. Мы работали очень быстро. Некоторую проблему создавало то, что у вируса Западного Нила есть несколько линий, насчитывают до семи, причем линию IV открыли именно мы в Волгограде в 2003 году. И праймеры нужны были немножко разные. До нас эту лихорадку Западного Нила изучали в основном французы в Африке, в Египте, и там больше было линии II. В 1999 году мы уже видели, что у нас другая линия, не вторая. Потом ее назвали первой, так как поняли, что эпидемически она важнее, чем вторая. (Актуальная классификация линий вируса Западного Нила представлена в статье 2021 года. В ней волгоградский вирус отнесен к восточноевропейской кладе линии 1 — PCR.NEWS.) Достаточно длинных сиквенсов нашей линии не было, и эту часть работы тоже пришлось делать самим. Диагностические праймеры ловили достаточно маленький кусок, порядка 250 нуклеотидов, а нужно было секвенировать порядка 400, чтобы понять, какие праймеры подойдут для более коротких сиквенсов. Это было сделано быстро.

Когда сиквенсы были готовы, кто занимался биоинформатикой?

Делал это я, потому что в тот момент владел этими вещами лучше всех в институте. Были более простые, чем сейчас, программы для анализа последовательностей, но для тех времен — передовые, даже открытые. Я пользовался программой MEGA. На анализ ушла пара дней. Если уметь, то это не очень сложно.

Праймеры, которые разработала ваша группа для первой линии, использовались другими исследователями?

По крайней мере, они были опубликованы. В России они никем не использовались, потому что особенно некому было использовать. Мало кто занимался самостоятельно ПЦР-диагностикой. А в Америке приняли во внимание, но больше работали со своими, хотя наши тоже их испытали и убедились, что они работают.

Сейчас для диагностики лихорадки Западного Нила используются те же праймеры, которые вы разработали?

Нет, конечно. Это следующее поколение праймеров для ПЦР в реальном времени, под современное оборудование.

С какими образцами проводится ПЦР в реальном времени, если в крови низкая вирусная нагрузка?

С любыми. Как выяснилось, можно видеть в моче РНК вируса. Можно надеяться поймать ее в крови, только для этого нужны пробы, взятые как можно раньше, или во второй пик виремии, где-то через неделю после появления клинических признаков. Чувствительность по-прежнему маленькая, но если мы в 1999 году не нашли ничего, то сейчас методом ПЦР можно подтвердить диагноз в 30% случаев. Если очень хорошо отбирать пробы и уметь ставить ПЦР — в 40%.

На конференции «Молекулярная диагностика 2021» спикеры отмечали, что исследователям доступно слишком мало образцов человеческого мозга. Согласно статье, опубликованной в Emerging Infectious Diseases, во время вспышки 1999 года 40 человек погибло от менингоэнцефалита, но у вас было только 14 образцов мозга. Этого было достаточно или хотелось бы больше?

Больше было бы полезно. Но и тех, которые были, хватило. Это были люди, умершие в течение той недели, когда мы были в Волгограде. Образцы мозга никто не брал до нас и не стали брать после нас — мы убедили местных, что это именно лихорадка Западного Нила.

Есть ли сейчас необходимость исследовать образцы мозга погибших людей?

Думаю, да, и не только на лихорадку Западного Нила. Многих людей, умирающих от энцефалита, который похож на инфекционный, по-хорошему надо исследовать. Может быть, больше с научной точки зрения, чем с диагностической. Потому что там могут быть самые разные неожиданные вирусы, и нужны уже современные методы детекции, в том числе детекции генетического материала неожиданных вирусов. Например, массовое секвенирование нового поколения, со сборкой и анализом.

Как предотвратить

Вы общались с американскими специалистами?

Да. Я всегда в таких случаях настроен на взаимодействие. Здесь ситуация немного осложнялась тем, что это была новая тема. Людей, которые занимаются менингококковой инфекцией, я знал вплоть до того, сколько у них детей и что они любят на завтрак. А эту команду я совсем не знал, поэтому я просто написал директору отделения арбовирусных инфекций Центров по контролю и профилактике заболеваний США Дуэйну Гублеру (Dwayne Gubler), с которым мы потом долго сотрудничали. Он даже в Россию приезжал, у нас был совместный проект. Мы стали сотрудничать, он пригласил меня принять участие в работе совещания, куда собирали специалистов по лихорадке Западного Нила со всего мира. Кроме меня позвали вирусологов Александра Михайловича Бутенко и Дмитрия Константиновича Львова. Но они не смогли поехать. У одного не было загранпаспорта, а другой просто заболел. Визу мне ставили сверхсрочно, чуть ли не за день.

Что вы обсуждали с представителями других стран? Это была выработка стратегии или просто обмен информацией?

Мы должны были понять, почему именно сейчас и почему в таком масштабе. Для России это было сравнительно легко. Высказать гипотезу было разумно, хоть и проверить ее нельзя. Уже из названия видно, что лихорадка Западного Нила — тропическая инфекция. Ее гнездо в Африке, а потом она перелетными птицами разносится туда, где эти перелетные птицы проводят лето и где вирус может размножаться. В российских регионах летние температуры в 1997-98-99 годах шли по нарастающей. В Волгограде это были одни из самых жарких лет вообще за XX век. Конечно, обсуждали, почему инфекция «выстрелила» в Америке, и до сих пор не разобрались. Естественно, говорили о мерах противодействия, которые достаточно очевидны: в первую очередь, это борьба с укусами комаров. Человек может одеваться в одежду с длинными рукавами, мазаться антикомариными кремами. Можно защитить жилье — не открывать окна настежь, завешивать их сетками. И можно идти от среды — проводить активные противокомариные обработки там, где много людей. Понятно, что по всей Волгоградской области комаров не выведешь, область большая, но в основных городах — в Волгограде, в Волжском — вполне можно усилить борьбу с комарами.

Действительно принимались меры на уровне городов?

Да. В первый год в России были затронуты Волгоград, Астрахань и Краснодар. В Краснодаре само прошло. В Астрахани было трудно бороться с комарами, потому что Астрахань вся окружена местами, где живет много комаров. Всю дельту Волги обработать невозможно — потравится Каспийское море. А в Волгограде это возможно, и в последующие годы это достаточно активно делалось.

Какое значение имело расследование 1999 года для расследования следующих российских вспышек?

В последующих вспышках все становилось понятным буквально на следующий день, потому что уже и опыт был, и ПЦР-диагностика. Следующая большая вспышка была в 2007 году, семь лет прошло. За это время и опыт появился, и амплификаторы в регионах. В основном их закупали для более глобальных целей, например, для диагностики гепатитов, но в диагностике Западного Нила их тоже можно было использовать. У нас еще получилось такое обстоятельство: в 2000 году заболеваемость была намного ниже, чем в 1999, в 2001 ниже, чем в 2000-м. А когда мы утвердили совместный российско-американский проект, в России Западный Нил ушел во тьму. И в рамках этого проекта мы занимались разными полезными вещами, но практически без больных.

Новые вспышки каждый раз были связаны с какими-то температурными аномалиями в регионах?

В общем, да. По-прежнему самые крупные вспышки были в Волгограде. Следующий теплый год после 1999-го был 2007-й. В 2010-м стало ясно, что при теплой погоде инфекция распространяется вплоть до Воронежской области. Может, она и в 1999 году распространялась, там никто не смотрел. В 2010-м уже смотрели, и было видно, что в Воронежской и Липецкой областях довольно много больных, ненамного меньше, чем в Волгограде, и даже больше, чем в Астрахани.

И в 2021 году лихорадка Западного Нила доехала до Москвы.

В единичных случаях она доезжала чуть раньше, и в прошлом году также добралась до Москвы. Согласно данным Роспотребнадзора в 2021 году было зафиксировано 27 случаев в Москве.

Как предсказать

Можно ли заболеть лихорадкой Западного Нила дважды?

Нет, нельзя. Какими болезнями мы болеем два раза? Теми, которые хоть и называются одинаково, но на самом деле не одинаковы. Например, грипп А и грипп В — это разные вирусы. Они заново выводятся в птицах Юго-Восточной Азии, поэтому гриппом можно болеть часто. То же самое мы видим сейчас с коронавирусной инфекцией: вирус достаточно быстро мутирует, то дельта, то омикрон. В этом смысле лихорадка Западного Нила более стабильна, и два раза ей болеть, скорее всего, нельзя.

Человеческой вакцины от лихорадки Западного Нила в мире пока нет.

Ее нет, потому что она коммерчески невыгодна. Ее можно было бы сделать, но заболевание не такое массовое, чтобы это было эффективно. Вспышки достаточно неожиданны, и непонятно, когда и кого прививать. Вакцины разрабатывались, выглядят они вполне симпатично, но для дальнейшего продвижения нужно было вкладывать огромные деньги в фармкомпанию, в испытания и прочее, и неизвестно, когда эти деньги вернутся. Есть коммерческая вакцина для лошадей. Лошади тоже болеют этой лихорадкой, тоже умирают. Требования к безопасности вакцины для ветеринарной области намного ниже.

Лошадиную вакцину пытаются адаптировать для птиц.

Это уже попытка прервать передачу. Лошадей защищают, но млекопитающие — это тупик для инфекции. Поскольку виремия достаточно низкая и короткая, комары очень редко могут заразиться от человека или от лошади и переносить инфекцию дальше. Эпидемического значения это явление не имеет. Птиц можно попробовать вакцинировать с целью прервать природный цикл лихорадки Западного Нила и тем самым уменьшить заболеваемость людей.

Есть ли у вас сейчас проекты, связанные с лихорадкой Западного Нила?

У института есть грант Российского научного фонда по наблюдению предпосылок к вспышкам инфекционных заболеваний из космоса. Из космоса намного быстрее, оперативнее и точнее можно следить за погодными условиями. (Если вы просто зайдете в Интернет, чтобы понять, какая погода в этом году была и какая ожидается, то на вас вывалится куча мусора. Там не поймешь, где опечатка, а где авторы сами придумали.) Но Есть знаменитый Институт космических исследований РАН. Он сам собирает данные со спутников, получает данные от коллег, умеет их анализировать, и с ними мы как раз и смотрим на такие предпосылки: температура какого месяца предсказывает вспышку лихорадки Западного Нила в этом году. Если она будет, она все равно будет в августе-сентябре, а предпосылки к этому можно увидеть в мае-июне. В это время идет размножение комаров, и уже из погодных данных можно заключить, много ли их будет. Это надо бы тоже проверить, но по ретроспективным данным так и получается. Из космоса видно не только погоду, но и обилие зеленой растительности, что тоже является предпосылкой: комарам есть где прятаться от солнца.

Метод только для лихорадки Западного Нила работает или для арбовирусных инфекций вообще?

Арбовирусные инфекции переносятся членистоногими. Массовых комариных инфекций, кроме лихорадки Западного Нила, нет. Не массовые, возможно, есть, но на моей памяти не было. К таким очевидным арбовирусным инфекциям, как клещевой энцефалит, можно было бы применить те же самые методы. Но так легко это не получается, потому что клещи имеют несколько фаз развития: яйцо, личинка, нимфа, взрослая особь. То есть распространение инфекции зависит от климатических условий не только в этом году, но и в прошлом и позапрошлом. Эта ситуация сложнее, и мы еще не настолько разобрались, чтобы можно было об этом рассказывать.

А.Е. Платонов с ловушкой Кришталя для сбора комаров и лягушкой. Фото предоставлено А.Е. Платоновым.

Добавить в избранное

Вам будет интересно