Мой вирусологический котел. Автобиографические заметки о научном марафоне

Раздел истории биологических и медицинских науки на портале PCR.NEWS открывают заметки Вадима Израилевича Агола о его работе в Институте по изучению полиомиелита Академии медицинских наук (сейчас ФНЦ исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М. П. Чумакова РАН).

С Дэвидом Балтимором
https://pcr.news/

Предыстория

В 1951 году я окончил 1-й Московский мединститут (ныне Сеченовский университет). Студентом серьезно увлекся биохимией и, работая под руководством профессора Ильи Ильича Иванова, даже накопил экспериментальный материал о некоторых аспектах механизма мышечного сокращения, достаточный для кандидатской диссертации. Но время для защиты тогда было неподходящее из-за двух пунктов моей анкеты — сын «врага народа» и национальность нехорошая, — и я был распределен в Казахстан, в Карагандинский мединститут (теперь тоже именуется университетом), где проработал пять лет. Диссертацию защитил (с рядом приключений) в 1954 году, a уволиться из мединститута и вернуться домой смог лишь в 1956-м. Но по вышеуказанным причинам найти в Москве хоть какую-то работу по биохимии, несмотря на значительные усилия и серьезную помощь с разных сторон, не сумел (подробности — в автобиографическом очерке [1]).

И тут мне крупно повезло — встретил Володю Гершановича, которого знал еще по институту, он учился на пару курсов младше. Володя после окончания института также поработал в советской Средней Азии, но успел вернуться в Москву раньше меня и уже был старшим лаборантом биохимической лаборатории в только что организованном Институте по изучению полиомиелита Академии медицинских наук. Он мне и порекомендовал провентилировать возможность пристроиться туда же, поскольку, по его словам, мои анкетные данные могли не испугать директора института, Михаила Петровича Чумакова.

У меня были большие сомнения. Во-первых, о вирусах я практически ничего не знал. Во-вторых, очень опасался за девятилетнюю дочку — ведь в Москве тогда гуляла эпидемия полиомиелита, которого все опасались, пожалуй, больше, чем теперешнего ковида. А вакцины против этой заразы в стране еще не было (именно по этой причине Институт по изучению полиомиелита и был организован). Но поскольку никаких альтернатив не было, после семейных обсуждений и серьезных колебаний решил все же поговорить с директором.

Этот разговор состоялся в августе в небольшом одноэтажном (правда, с рабочим подвалом) здании барачного типа на территории инфекционной больницы на Соколиной горе, в котором размещалась вся вирусологическая часть института (было еще клиническое отделение и склад, но они находились в других местах). Директорский кабинет представлял собой небольшую каморку, в которой кроме ее хозяина, если правильно помню, мог поместиться только один человек (а в секретарском «предбаннике» ожидающему посетителю вообще присесть было негде).

Михаил Петрович сразу же сделал мне судьбоносное предложение — должность младшего научного сотрудника лаборатории биохимии. И уж совсем неожиданно заговорил о том, что хотел бы послать меня на стажировку в какую-нибудь передовую зарубежную лабораторию. Немного ошарашенный, я сказал, что должен подумать. После непростых дополнительных размышлений все же подал заявление и 3 сентября 1956 года был зачислен в институт, в котором проработал 65 лет.

Заявление о приеме на работу

Этот день действительно определил мою судьбу. Здесь я обрел свою специальность и глубокие научные интересы. Да и личная жизнь и круг друзей так или иначе были тесно переплетены с работой в Институте.

Лаборатория, в которую пришел

Основателем и заведующим лабораторией биохимии был один из первых советских вирусологов Владимир Иванович Товарницкий, который также заведовал лабораторией в Институте вирусологии имени Д.И. Ивановского. Но вскоре разгорелась борьба с совместительствами в научных учреждениях, и он вынужден был покинуть наш институт, так и не опубликовав, как мне кажется, ни одной выполненной здесь научной работы. Руководство лабораторией перешло к молодой и энергичной Рахили Натановне Этингоф, работавшей до этого в 1-м Московском мединституте, поэтому с ней я был уже знаком.

Вся лаборатория (если не считать холодной и термальной комнат, а также стола в коридоре) помещалась в бывшем процедурном кабинете больницы, разделенном перегородкой. Там помимо Рахили Натановны и нас с Володей помещались старший научный сотрудник Иван Иванович Горелов (также вскоре ушедший и ничего не опубликовавший), молоденькие, тоже еще неостепененные Инна Гумина и Алла Кричевская (впрочем не уверен, что они пришли сюда еще до меня), а также две несовершеннолетние девочки-лаборантки, одна из которых — Люся Романова — вскоре стала моей личной помощницей, потом — активным научным сотрудником, а еще через много лет — женой.

По меркам того времени лаборатория была поразительно хорошо оборудована. Для оснащения нового института импортными приборами Михаил Петрович получил весьма значительную сумму валюты, а будучи в командировке в США, умудрился ее превысить аж на полмиллиона долларов. Причем безнаказанно. И лабораторию биохимии он в обиде не оставил. У нас были не только очень нужные, но и бесполезные (неиспользовавшиеся) дорогие приборы, которых в Москве больше никто не имел. Поглядеть на эти диковинки к нам приходили, как в музей. Даже такие люди, как зав. кафедрой биохимии животных МГУ Сергей Евгеньевич Северин.

Однако огромной проблемой были реактивы — некоторые приходилось дополнительно очищать или синтезировать самим. Невозможно было купить какие-то необходимые вещества биологического происхождения. Так, цитохром с мы выделяли из бычьих сердец, которые приобретали на Микояновском мясокомбинате, а некоторые ферменты извлекали из пивных дрожжей. За ними отправлялись на Бадаевский пивзавод. Для культивирования клеток нужна была телячья сыворотка, которой в продаже не было. Приходилось с громадной бутылью ездить на подмосковную бойню, где прямо в эту бутыль лили кровь, вытекавшую из забиваемых телят. Потом мы из нее выделяли сыворотку и стерилизовали путем фильтрования. Хватало на несколько месяцев.

Когда я пришел в лабораторию, никто из нас (кроме, конечно, Товарницкого) не обладал сколько-нибудь серьезными познаниями в области вирусологии, правда и особых стремлений углубить эти знания не проявлял. Рахиль Натановна вместе с Володей еще до прихода сюда начали изучать углеводный обмен в раковых клетках и уже опубликовали статью на эту тему. Сохранив интерес к проблеме, они продолжили и здесь ее изучение, используя в качестве объекта клетки, культивируемые in vitro. Выглядело это вполне закономерно и оправданно, ведь именно в таких тканевых культурах в институте получали вирус полиомиелита (кстати, всего за несколько лет до того за возможность таким путем размножать этот вирус была присуждена Нобелевская премия американским вирусологам Джону Эндерсу, Томасу Уэллеру и Фредерику Роббинсу).

И я охотно к ним присоединился. Работали мы достаточно успешно и опубликовали несколько вполне достойных статей. Я выступал с докладами на московских и всесоюзных конференциях и даже переписывался на эту тему с видными зарубежными учеными. Но непосредственного отношения к задачам института и интересам Михаила Петровича эта проблематика отношения не имела. У директора терпение постепенно истекало, и он даже как-то сказал, что нашей «синагоге» пора бы заняться чем-нибудь более дельным. Впрочем, в его устах это не звучало сколько-нибудь оскорбительно, и он продолжал относиться к нам вполне благожелательно. Пытаясь пойти ему навстречу, Рахиль Натановна развернула исследования, направленные на «импортозамещение» — замену дорогих импортных реактивов, используемых для приготовления питательных сред для культивирования клеток, отечественными препаратами.

Как и чем жил институт

Институт жил тогда совсем другой жизнью. Сначала стояла актуальная задача очень быстро наладить массовое производство убитой противополиомиелитной вакцины, только что разработанной Джонасом Солком. Как я уже упомянул, Михаил Петрович побывал в командировке в США, где детально ознакомился с технологией ее производства и где она уже прошла необходимые испытания. И эта непростая технология была освоена в Институте в немыслимо короткий срок молодым энергичным коллективом, которому пришлось все начинать буквально с нуля. Миллионы доз вакцины были выпущены за пару лет. Это произошло еще во второй половине 50-х годов прошлого века.

Но в этой же командировке Михаил Петрович познакомился и завел тесный контакт и с другим американским вирусологом Альбертом Сэбином (сейчас принято написание «Сэйбин»), который разрабатывал альтернативную вакцину против полиомиелита, основанную на использовании ослабленных (аттенуированных), но живых вариантах вируса. Если с убитой вакциной новых особо важных научных вопросов не возникало, то с живой был ряд неясных фундаментальных проблем. Главная из них — насколько она безопасна? Это был очень важный вопрос, и серьезные ученые и опытные организаторы здравоохранения выражали вполне обоснованные опасения по этому поводу. Я не буду здесь подробно описывать всю историю (у меня есть специальная публикация на эту тему [2]), скажу лишь что реальную путевку в жизнь эта замечательная вакцина получила именно в СССР, благодаря интуиции и энергии Михаила Петровича, сумевшего преодолеть, казалось бы, непреодолимые преграды. И это случилось на рубеже 50-х и 60-х годов.

Здесь я рассказывал об атмосфере, которой я дышал по приходе в Институт.

Конечно же, он и потом жил весьма активно и продуктивно.

Мой дальнейший «научный марафон»

О том, что было дальше, я коротко уже рассказывал в интервью, которое недавно давал Наталии Лесковой для PCR.NEWS. Фактически здесь — продолжение и дополнение того разговора. Замечу, что исходно этот текст был подготовлен (тоже в виде интервью) для музея Михаила Петровича Чумакова в Федеральном научном центре исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова РАН. Но с благодарностью откликнувшись на любезное предложение Н. Лесковой, попытался сделать его — после некоторых добавлений и небольшого редактирования — доступным и для более широкого круга читателей. Разумеется, смогу упомянуть здесь только о наиболее важных этапах, пройденных на весьма длинном маршруте. Ссылки на некоторые из соответствующих публикаций (в которых названы и коллеги-соавторы), приведены в недавно опубликованном обзоре [3].

Михаил Петрович действительно предпринял серьезные попытки послать меня на стажировку за рубеж, чтобы я там все-таки стал вирусологом. Сначала речь шла о Швеции, а потом он переключился на США — Калифорнийский университет в Беркли. Там только что впервые сумели закристаллизовать вирус полиомиелита, что позволило проникнуть в его структуру. Я даже подписал университетскую анкету. В ней дал буквально клятву (the oath) не свергать силой ни правительство Соединенных Штатов, ни правительство штата Калифорния. Однако из страны меня не выпустили — возможно, из-за этого легкомысленного обещания.

С М.П. Чумаковым где-то в конце 50-х годов

Но тем не менее постепенно я и сам начал проявлять интерес к вирусам, и занялся выяснением некоторых различий между дикими штаммами вируса полиомиелита и его вакцинными производными. Первое сообщение на эту тему мы совместно с Маргаритой Чумаковой (однофамилицей Михаила Петровича) опубликовали в 1960 году в «Вопросах вирусологии», а в начале 1962 года вышла небольшая наша статья в журнале Virology. Это было уже вполне серьезное исследование, которое, как мне кажется, не потеряло значение по сей день. Мы показали, что аттенуированные Сэбином штаммы, в отличие от диких, при определенных условиях взаимодействуют с сульфированными полисахаридами. Важность этого наблюдения в том, что на поверхности клеток животных (а также в их крови) есть подобные соединения, и они, как теперь известно, играют важную роль во взаимодействии с клетками некоторых вирусов (в том числе энтеровирусов, к которым относится и вирус полиомиелита). Мы тогда выяснили некие дополнительные детали этой особенности вакцинных полиовирусов, но до понимания значения этого свойства для уровня патогенности вируса дело не дошло. Неизвестно это значение и в наше время. В течение всей научной карьеры у меня возникало желание прояснить эту ситуацию, но, увы, руки никак не доходили.

Этот эпизод, ставший стартом моего вирусологического марафона, по времени приблизительно совпал с изменением статуса. По семейным обстоятельствам Рахиль Натановна в 1961 году переехала в Ленинград, и заведовать лабораторией Михаил Петрович поручил мне.

Взаимодействие между вирусами

Почти на протяжении всей научной карьеры меня интересовало, как вирусы могут взаимодействовать между собой. Так, еще в 1964 году мы опубликовали доказательства того, что при одновременном размножении в клетке двух различающихся по свойствам штаммов вируса полиомиелита, белок, закодированный в одном из них, может помочь партнеру размножаться при условиях, при которых он самостоятельно это сделать бы не смог . Мы обнаружили и описали это важное явление — комплементацию у РНК-содержащих вирусов — одновременно с несколькими группами зарубежных ученых.

У этих вирусов существует и другой вид взаимодействия — рекомбинация, когда генетический материал (фрагмент РНК) одного партнера ковалентно встраивается в геном другого. Сведения о возможном существовании этого явления у РНК-вирусов появились еще в начале 60-х годов прошлого века, но они имели косвенный характер и не получили всеобщего признания. Посетивший наш институт видный американский вирусолог Джозеф Мельник, узнав, что я исследую рекомбинацию между полиовирусами, с удивлением спросил, неужели я действительно верю в ее существование? Но мы верили и в 1980 году опубликовали первые строгие биохимические доказательства рекомбинации между РНК-вирусами, продемонстрировав, что в геноме рекомбинанта между двумя серотипами полиовируса последовательности, кодирующие структурные белки вириона, происходят от одного партнера, а неструктурные белки (необходимые для его размножения) унаследованы от другого.

Вскоре мы прояснили возможный механизм этого процесса, получив экспериментальные данные в пользу и в развитие предложенной ранее модели репликативной рекомбинации со «сменой матрицы». По нашей гипотезе, этот процесс включает образование гетеродуплексной структуры между гомологичными участками молекул рекомбинирующих РНК-геномов. Вирусный фермент, РНК-зависимая РНК-полимераза, начав синтез комплементарной цепочки на одной из этих молекул, точно прыгает (вместе с только что синтезированным фрагментом РНК) на оказавшееся по соседству правильное место молекулы-партнера, на матрице которой и заканчивает образование химерного потомка. Эта модель, в частности, предсказывала локализацию и неравномерное распределение в вирусном геноме удобных мест для таких прыжков.

Через некоторое время мы получили доказательства существования еще одного, принципиально другого и ранее не предсказанного — нерепликативного — механизма РНК-рекомбинации. В этом случае «сшивание» фрагментов разных молекул РНК происходит без участия вирусной РНК-полимеразы. Выяснились также некоторые детали этого процесса.

На лабораторных «посиделках»

Слева направо: Катя Викторова, Женя Кунин, Костя Чумаков, Лена Воробьева (лаборантка); крайний справа – я
Я со Светланой Масловой
Гриша Ширман с Нинель Захаровной Закс (хозлаборанткой)

Изменчивость, разнообразие и эволюция вирусов

Нередко вирусы попадают в условия (организм или клетку), неблагоприятные для их размножения. Мы посвятили ряд работ поразительной устойчивости и приспособляемости, которые при этом проявляют именно РНК-вирусы. Из-за более выраженной (по сравнению с ДНК-вирусами) неточности репликации генома у них очень высока способность восстанавливать жизнеспособность путем мутаций и рекомбинаций. В том числе они могут приобретать и существенно новые адаптивные качества, «изобретая» или где-то заимствуя новые белки или регуляторные РНК-элементы.

Особое место среди моих эволюционных работ занимает обзор, опубликованный в 1974 году, посвященный рассмотрению всех теоретически мыслимых (а не только тогда обнаруженных) способов передачи генетической информации у вирусов. За несколько лет до этого выдающийся американский вирусолог, нобелевский лауреат Дэвид Балтимор заложил фундамент существующей и теперь классификации вирусов. Он распределил их в шесть групп, различающихся по структуре геномов и механизму образования мРНК, обеспечивающих синтез вирусных белков. Группы I и II — одноцепочечные и двуцепочечные ДНК-вирусы; группа III — вирусы с двуцепочечными РНК-геномами; группа IV — с одноцепочечными (–)РНК-геномами (т.е. неспособными напрямую — до образования комплементарных молекул — направлять синтез белков); группы V и VI — вирусы с одноцепочечными (+)РНК-геномами, в первой из которых образование новых молекул мРНК происходит при участии промежуточных молекул РНК, а во второй в этот процесс включены и молекулы ДНК (т.е. имеет место обратная транскрипция).

С Дэвидом Балтимором

В моей гипотетической иерархической системе учитывались различия не только в способах синтеза мРНК, но и в механизмах репликации самих вирусных геномов. В ней было 35 классов, различающихся по этим признакам. Известные к тому времени вирусы размещались в восьми из них. Я обсуждал в этом обзоре причины, которые могли бы затруднять или препятствовать заполнению «пустых» классов, но в то же время высказал предположение о существовании вирусов с некоторыми теоретически возможными, но тогда еще не обнаруженными способами передачи и реализации генетической информации. Некоторые из этих предсказаний сбылись вскоре после публикации обзора.

По инициативе Евгения Кунина, моего бывшего ученика, а ныне выдающегося американского ученого, им в соавторстве с Мартом Круповичем и мною был недавно опубликован обзор [4], посвященный пятидесятилетию классификации Балтимора. Там есть специальный раздел, в котором рассматривается состояние вышеупомянутых проблем, которые я поднимал тоже почти полвека назад. В частности, к восьми заполненным классам предложенной ранее системы (из 35 постулированных) добавилось еще шесть.

Вирусные белки и РНК

Третий обширный круг интересовавших нас вопросов — свойства и механизмы образования вирусных белков и РНК. Изучали мы эти проблемы на примере пикорнавирусов — обширной группы мелких икосаэдрических вирусов, содержащих одноцепочечную геномную РНК положительной полярности. Исследуя клетки, зараженные вирусом энцефаломиокардита (ВЭМК), мы установили, что один из присутствующих там белков (называвшийся тогда р22, а теперь 3С), является вирусным и обладает протеолитической активностью. В частности, был картирован участок вирусной РНК, в котором он закодирован. Это были оригинальные данные о наличии протеаз среди белков, образуемых РНК-вирусами.

В то время было известно, что в начале (на N-конце) высокомолекулярного полипротеина, синтезируемого пикорнавирусами, располагаются капсидные (структурные) белки. Мы же обнаружили, что в случае ВЭМК на этом месте находится небольшой белок, который быстро отрезается вирусной протеазой. Этот белок, названный нами лидерным (L), стал таким образом родоначальником обширного семейства лидерных белков разных пикорнавирусов. К этим разнообразным белкам у меня возник особый интерес, о котором скажу немного дальше.

Когда были расшифрованы нуклеотидные последовательности РНК нескольких пикорнавирусов, оказалось, что на обоих концах у всех этих молекул есть протяженные нетранслируемые участки (untranslated regions, UTR). Нам удалось внести существенный вклад в выяснение их пространственной конформации и охарактеризовать функциональное значение некоторых их элементов. В частности, оказалось, что у ряда энтеровирусов протяженный центральный участок 5'-UTR имеет очень сходную укладку, которая кардинально отличается от достаточно консервативной укладки аналогично расположенного района генома других пикорнавирусов — кардиовирусов (в частности, ВЭМК) и афтовирусов (в частности, вируса ящура).

Конечно, нас весьма заинтриговало возможное биологическое значение этих структур. Тем более, что мы уже имели определенный задел для поиска подходов к этой проблеме. Для изучения механизмов трансляции принято было использовать бесклеточные системы (экстракты разрушенных клеток). Очень популярны были лизаты ретикулоцитов кролика. Однако продукты, получаемые при добавлении к ним пикорнавирусных РНК, сильно отличались от тех, которые образуются в зараженных клетках. Мы обнаружили, что это различие практически полностью исчезает, если вместо ретикулоцитных лизатов использовать экстракты мышиных асцитных раковых клеток, из которых эндогенные мРНК предварительно удалялись путем обработки нуклеазой.

Было известно, что у РНК пикорнавирусов на 5'-конце нет «кэпа» (метилированного гуанилата), который, как считалось, совершенно необходим для привлечения рибосом и трансляции в клетках эукариот. Как же тогда синтезируются вирусные белки? Мы обнаружили (и опубликовали в 1985 году), что в нашей усовершенствованной бесклеточной системе РНК вакцинных штаммов Сэбина транслируются заметно менее эффективно, чем РНК их более патогенных «диких» предшественников. Учитывая, что геномы этих аттенуированных потомков несут мутации в определенном участке центрального района 5'-UTR, мы высказали довольно смелое предположение, что этот район как-то задействован в инициации трансляции РНК. Развивая эту гипотезу, мы вскоре обнаружили, что лизаты ретикулоцитов приобретают способность правильно (но все равно с разной эффективностью у вирулентных и вакцинных штаммов полиовируса) транслировать вирусные РНК, если к ним добавить определенную белковую фракцию из нашей вышеупомянутой бесклеточной системы. Этот факт указывал на то, что для функционирования (матричной активности) постулированного района вирусных 5'-UTR - необходимы некие определенные клеточные белки. Еще через год лаборатории Экарда Виммера и Нахума Соненберга доказали, что эти районы 5'-UTR, действительно, являются ключевыми регуляторными цис-элементами пикорнавирусной трансляции — местами для внутренней посадки рибосом (IRES, Internal Ribosome Entry Sites).

Продолжая этот цикл работ, мы выявили некоторые важные функциональные олигонуклеотидные последовательности в структурно-различающихся IRESах и идентифицировали несколько клеточных белков, которые необходимы для IRES-зависимой инициации трансляции пикорнавирусных РНК, но не оказывают существенного влияния на работу кэпированных клеточных мРНК. Выяснилось, что разные типы IRESов нуждаются в разных белках-помощниках, при том, что разные клетки даже одного организма могут существенно различаться по содержанию таких белков. Эти факты существенно расширили наше понимание механизмов, регулирующих вирусный тропизм. Нужно отметить, что в этих исследованиях важнейшую роль сыграла кооперация с моими бывшими учениками-сотрудниками, работавшими в то время уже в зарубежных лабораториях.

В круге наших интересов был и другой нетранслируемый сегмент пикорнавирусных РНК — последовательности, примыкающие к их 3'-концам. Мы выявили существенные различия пространственной организации 3'-UTR даже среди разных энтеровирусов (т.е. внутри одного рода пикорнавирусов). Мутационные повреждения этого района приводили к нарушению синтеза негативных (комплементарных) цепей вирусных РНК и к другим аномалиям репликации генома. И эти работы мы проводили в тесном сотрудничестве с нашими зарубежными коллегами-друзьями.

На протяжении многих лет мы неоднократно возвращались к изучению и других аспектов репликации пикорнавирусных РНК. Так, еще в конце 70-х годов впервые обнаружили вовлеченность в этот процесс клеточных белков. В частности, как мы выяснили через некоторое время, они могут принимать участие в доставке строительного материала (нуклеозидтрифосфатов) непосредственно на «строительную площадку» — образующиеся в зараженной клетке специальные органеллы, в которых идет синтез вирусных РНК.

Патогенность вирусов

Природа патогенности вирусов — еще одна обширная область наших научных интересов. Здесь есть две перекрывающиеся территории — генетические детерминанты болезнетворности вирусов и клеточные мишени, которые первично страдают от вирусной активности.

В результате анализа структуры геномов специально сконструированных рекомбинантов между патогенными и аттенуированными штаммами полиовируса мы выяснили, что основные детерминанты патогенности находятся в левой половине вирусной РНК, но и правая ее половина также вносит некоторый зловредный вклад. До этого рекомбинантный анализ для исследования детерминант патогенности РНК-вирусов не применялся.

Более точная локализация группы аттенуирующих мутаций в полиовирусной 5'-UTR — в районе нуклеотидных позиций 472–481 — была выявлена в вышеупомянутых опытах по сравнению эффективности трансляции геномов диких и вакцинных штаммов этого вируса. Насколько знаю, это было первое прямое свидетельство возможной корреляции между патогенностью РНК-вируса и его трансляционной активностью. Вскоре мы обнаружили, что и другой элемент IRESa — включающий богатый пиримидинами олигонуклеотид и криптический (практически не функционирующий в качестве инициаторного кодона трансляции) AUG — вносит значительный вклад в нейровирулентность полиовируса. Впрочем, как мы выяснили потом — не только полиовируса, но также и кардиовируса, патогенного для мышей, IRES которого, структурно отличающийся от полиовирусного, такой элемент тоже содержит. Причем в данном случае он контролирует не просто уровень нейровирулентности. В зависимости от структуры этого района клинические симптомы у зараженных мышей варьировали от тетраплегии с летальным исходом до полного выздоровления после незначительных неврологических признаков.

Много внимания мы уделяли выяснению природы патологических изменений, возникающих в зараженных пикорнавирусами клетках. Один аспект был непосредственно связан с рассмотренными выше особенностями трансляции их РНК. Ведь IRES-содержащие РНК эффективно конкурируют с клеточными мРНК за рибосомы и, следовательно, за контроль над белоксинтезирующим аппаратом. Это важная (но отнюдь не единственная) причина вызываемых пикорнавирусами нарушений клеточной протеомики.

Хотя репродукция пикорнавирусов происходит в цитоплазме, в осуществлении этого процесса принимают участие и некоторые ядерные белки. Мы обнаружили, что пикорнавирусы (в том числе полиовирус) быстро повышают проницаемость ядерной оболочки. Для вируса это хорошо, а вот клеточный метаболизм сильно страдает. Тем более, что ядерно-цитоплазматический транспорт облегчается в обоих направлениях. Это приводит к тому, что вирусные белки индуцируют некоторую патологию и внутри клеточного ядра. Далее выяснилось, что в случае полиовируса повышение проницаемости ядерной оболочки обусловлено разрушением нуклеопоринов (белков, входящих в состав ядерных пор) вирусным белком 2А, обладающим протеолитической активностью. А вирусу энцефаломиокардита (вышеупомянутому ВЭМК), у которого нет гомолога полиовирусного 2А, приходится для достижения той же цели действовать принципиально другим способом. В этом случае пермеабилизация ядерной оболочки происходит в результате избыточного фосфорилирования нуклеопорина. Этот процесс запускается вирусным лидерным (L) белком, который у данного вируса никакой ферментативной активностью не обладает. Судя по всему, этот вирус «приватизирует» часть нормального клеточного механизма, работающего при митозе. Тот факт, что разные вирусы достигают одинакового результата разными способами, подчеркивает важность для них этого результата.

Самый яркий показатель вирусной патогенности — гибель зараженной клетки. Долгие годы популярной была гипотеза, что основная причина этого явления — истощение клеточных ресурсов из-за того, что они направляются на выработку вирусного потомства. Мы причастны к развитию другого взгляда. Дело в том, что в геноме эукариот закодированы программы клеточной гибели, которые проявляются при некоторых внутриклеточных «беспорядках», а в многоклеточных организмах — и при нормальной дифференцировке органов. И еще в середине 90-х годов мы впервые обнаружили, что причиной смерти зараженной пикорнавирусами клетки может быть апоптоз – один из сценариев такой генетически запрограммированной смерти. А вскоре доказали, что наши вирусы способны выключать эту программу, используя свойства некоторых своих белков. Отсюда вытекало, что вирус «не заинтересован» в убийстве клетки, а что она сама подвергает себя самоубийству, дабы не стать «фабрикой» по производству нового вирусного поколения. Более того, мы обнаружили, что клетка настолько готова к самопожертвованию, что при вирусном выключении апоптоза она может запускать другую — некротическую – программу собственной гибели. А у вирусов есть средства бороться и с этой (в данном случае – противовирусной) программой. Изучению этих сложных взаимоотношений была посвящена серия наших работ.

Результатом (помимо выяснения ряда конкретных деталей) стало развитие следующей общей концепции. В клетке в ответ на заражение вирусом могут активироваться два типа самоубийственных (но защитных для организма) противовирусных программ — апоптотические и некротические. Для противодействия им у разных пикорнавирусов есть противозащитное вооружение, в первую очередь (но не только), специальные функции двух белков, L или 2А, которые мы назвали «секьюрити-белками». Конкретный исход этого противодействия зависит от природы вируса, особенностей клетки и конкретных условий. Я излагаю здесь эту точку зрения довольно упрощенно, но то, что вирус-убийца может чувствовать себя вполне комфортно, не совершая убийства, было доказано следующим нашим экспериментом: при использовании менговируса (кардиовируса) с мутантным L-белком в присутствии определенного ингибитора программируемой клеточной гибели полный вирусный урожай успевает созреть до сильно отсроченного цитопатического эффекта. Отсюда вытекает, между прочим, весьма важное следствие — для предотвращения тяжелых клинических симптомов вирусных заболеваний могут оказаться полезны (как это ни парадоксально) и определенные лекарства, подавляющие противовирусную защиту организма.

Полиомиелит

Ну, и еще одно направление, которым мы активно занимались — это молекулярная эпидемиология полиомиелита и борьба против этой болезни. Наше описание случаев паралитического полиомиелита, вызванных производными живой вакцины (в частности, полиовирусом серотипа 2), было среди первых, посвященных этой до сих пор животрепещущей проблеме. Мы изучали закономерности эволюции вакцинных вирусов (в частности, возможность их длительной криптической циркуляции) и характер накапливающихся в них мутаций (в том числе, повышающих нейровирулентность). Выявили, что у невакцинированных детей даже мало измененные производные вакцины могут (конечно, чрезвычайно редко) вызвать ограниченную вспышку заболевания.

С другой стороны, в работе, опубликованной еще в 2003 году, посвященной ситуации, сложившейся в Белоруссии после временного локального прекращения использования живой вакцины, показали, что такая тактика может привести к широкой циркуляции и эволюции вакцинных производных. Этот, открытым текстом предсказанный, опасный сценарий действительно реализовался после рекомендованного Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) изъятия серотипа 2 из оригинальной живой трехвалентной вакцины Сэбина и замены его на инактивированный вирус. Реализовался он, несмотря на то что вместе с видными американскими коллегами мы возражали (в публикациях в авторитетных журналах) против прекращения использования живой вакцины. Другое дело, что такую вакцину необходимо и возможно сделать более стабильной и безопасной.

Рассказывая о своей работе в Институте полиомиелита, конечно же, должен с большой благодарностью вспомнить о той неизменной поддержке, которую мне оказывал Михаил Петрович Чумаков на протяжении всего его директорства. Это касалось не только содействия в обеспечении лаборатории необходимым оборудованием (к примеру, мы были одними из первых в стране обладателей американской ультрацентрифуги Spinco), но и неоценимой помощи даже, например, в улучшении жилищных условий моих сотрудников (предоставлении институтского жилья, получении московской прописки и т.д.). А у меня ведь с ним не было ни одной общей публикации! Его благожелательное отношение не менялось, несмотря на несколько конфликтных ситуаций, возникавших, когда он пытался привлечь меня к сотрудничеству в каких-то важных для него исследованиях (например, касающихся трахомы). После одного из таких конфликтов он пришел к нам в лабораторию как-то вечером, когда мы все еще работали, со словами: «Если Магомет не идет к горе, гора идет к Магомету».

О коллегах, с которыми работал

Как уже было сказано, в этом тексте почти нет ссылок и, соответственно, фамилий соавторов публикаций. На самом деле описанные результаты, конечно же — продукт коллективного труда. При этом команда лаборатории биохимии Института полиомиелита была теснейшим образом интегрирована с отделом взаимодействия вирусов с клеткой (который я основал в 1964 году и которым также руководил по 2019 год) Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ. За весь период моего руководства в нашей работе принимало участие порядка полусотни сотрудников этих двух подразделений. Из них кандидатские диссертации выполнили 35 человек, а докторские — 5. Это была дружная команда, в которой жизнь иногда доходила до точки кипения. Вариться в этом котле было для меня неслыханной удачей и настоящим наслаждением. Разумеется, отдать должное всем бывшим ученикам/сотрудникам здесь нет никакой возможности. Назову только несколько имен из числа тех, кто был движущей силой в значительном числе наших работ (по справедливости, этот список, возможно, надо было бы по крайней мере удвоить), а также тех, кто, получив у нас определенный заряд, в дальнейшем намного сильнее раскрыли свои способности за рубежом.

В открытии комплементации у полиовируса большая заслуга Гриши Ширмана (имена буду называть так, как они звучали в лаборатории). Уже упоминавшаяся Люся Романова, проработавшая в лаборатории всю научную жизнь, внесла важный вклад в исследование таких разных вирусных процессов, как репликация, рекомбинация, трансляция и патогенность, используя биохимические, вирусологические и электронно-микроскопические подходы. Она также принимала активное участие в обучении «новичков» и много времени тратила на всякие организационные дела. В разнообразных исследованиях активную роль играла и Светлана Маслова. В работы по расшифровке механизмов вирусной трансляции внесли ключевую лепту Юра Свиткин, Женя Пилипенко и Толя Гмыль. Толя — также основной участник открытия нерепликативной РНК-рекомбинации. Будучи моим главным помощником на протяжении многих лет, он принимал важное участие и в других работах, а после моего 80-летия возглавил лабораторию. Серьезный вклад в изучение взаимодействия вирусов с клеткой внес и Петя Лидский.

Во вторую группу я бы в первую очередь отнес, пожалуй, пятерых. Саша Горбаленя в начале карьеры — первооткрыватель (вместе с Юрой Свиткиным) протеаз у РНК-вирусов, а в дальнейшем он по собственной инициативе увлекся биоинформатикой, став фактически одним из пионеров этой области биологии. Работая впоследствии в США и Голландии, он весьма эффективно продолжил эти исследования. А еще будучи в нашем коллективе, привлек к этой тематике Женю Кунина, который начинал здесь с изучения особенностей репликации пикорнавирусных РНК (этому посвящена его кандидатская диссертация), но довольно быстро переключился на эволюционную биологию и после эмиграции в США стал одним из ее признанных мировых лидеров (по данным Google Scholar, на конец сентября 2022 года его статьи процитированы почти 230 тысяч раз, а его индекс Хирша равен 229). Таня Пестова, приобщившись у нас к изучению механизмов трансляции вирусных РНК, остается в гуще этой проблематики и в США, внося в ее развитие очень значительный вклад. Сын Михаила Петровича Чумакова, Костя, тоже начинавший у нас с молекулярно-биологической тематики, постепенно переключился в основном на вакцинологию. О его вкладе в эту область и значимости говорит справка из Википедии: «Заместитель директора по науке, ведущий научный сотрудник и начальник лаборатории отдела исследований и анализа вакцин… Управления по надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). Директор Центра передового опыта Глобальной вирусологической сети». Весьма успешно работает в США и Жора Белов, до этого один из ключевых участников ряда наших работ о вирус-индуцируемых программируемой клеточной гибели и нарушениях ядерно-цитоплазматического транспорта.

Ученики, сотрудники, коллеги в молодости

Слева направо: Юра Свиткин, Женя Пилипенко, Таня Пестова
Саша Горбаленя и Люся Романова
Слева направо: я, Толя Гмыль, Женя Пилипенко, Жора Белов

Сварить столь значительный объем разноплановой продукции только собственными силами, без многочисленных коопераций мы, конечно же, не смогли бы. Из сотрудников других лабораторий Института полиомиелита (а мы продуктивно работали со многими) я бы, пожалуй, особо выделил Елену Алексеевну Тольскую, принимавшую активное участие в разных исследованиях. Среди наших соавторов немало коллег и из других советских/российских учреждений, а также (что очень важно) более полусотни зарубежных исследователей. Посчастливилось сотрудничать, в частности, с такими известными вирусологами, как (буду перечислять их фамилии в русском алфавитном порядке) Курт Бинц (Bienz), Экард Виммер (Wimmer), Марк Жирар (Girard), Олен Кью (Kew), Вилем Мелкерс (Melchers), Реймонд Рус (Roos), Нахум Соненберг (Sonenberg), Франк ван Куппевелд (van Kuppeveld), Элли Эренфелд (Ehrenfeld).

Несколько небезынтересных штрихов

В заключение — несколько штрихов, как-то характеризующих атмосферу, которая нас тогда окружала.

Почти с самого начала мы старались стать членами международного научного сообщества и публиковать свои результаты в международных журналах. Но делать тогда это было совсем непросто. Кратко говоря, процедура была следующей. Сначала полагалось иметь по этому вопросу какую-то русскую публикацию и только после этого можно было представить в специальную институтскую комиссию (в состав которой входили, насколько помню, представители партийной и профсоюзной организаций) английский и русский тексты планируемой статьи. Комиссия должна была выдать справку (с несколькими подписями и скрепленную институтской печатью), в которой бы утверждалось, что в этой статье ничего нового не содержится. Далее рукопись отвозили в Главлит (специальный государственный цензурный орган, существовавший до 1991 года) и оттуда через некоторое время получали разрешение на отправку статьи за рубеж. С этим разрешением ехали на Главпочтамт и отправляли статью заказной авиапочтой в редакцию. По дороге статья проходила дополнительную проверку соответствующих органов и поэтому доставлялась адресату примерно через месяц. Какое-то время там уходило на рецензирование, и замечания рецензентов приходили к нам авиапочтой (этот путь по той же причине также занимал примерно месяц). После этого нам надо было внести исправления, а иногда и поставить новые эксперименты. Полет за рубеж исправленного варианта был столь же длительным.

Много лет каждую осень во время уборки урожая полагались обязательные многодневные командировки всех сотрудников Института полиомиелита на подмосковную овощную базу – что-то сортировать, разносить и т.п. Иногда в качестве поощрения нам дарили какие-то овощи. Чтобы не прерывать работу, мы обычно ездили туда во вторую смену. Раз приехали, а тамошняя сотрудница говорит:

— Работа отменяется — автокар не работает.
— Что, сломался?
— Нет. Водитель пьяный. А у вас мужчина есть?
— Вот, заведующий лабораторией, профессор Агол.
— Ну, так пусть он и сядет на кар.
— А он не умеет.
— Так он же профессор!

Я сел и действительно справился. Всю смену отработал.

Компьютеров, разумеется, длительное время еще не было, и перед большими праздниками из лаборатории уносили все пишущие машинки (дабы мы не напечатали что-нибудь неподходящее), а все комнаты опечатывали сургучной печатью.

А праздновать в нашем дружном коллективе любили и умели. Помимо официальных праздников отмечали пиршествами дни рождения и другие важные события. Нередко устраивали и веселые пикники в лесу на берегу озера недалеко от Института полиомиелита. Внизу – снимки, сделанные там на одном из таких пикников во время международного симпозиума где-то в начале 2000-х г.г. На одном – Экард Виммер, а на другом – игра в «ручеек», где на переднем плане — я с Элли Эренфелд. Оба американских гостя – в предоставленной нами одежде, поскольку, несмотря на весну, было необычно прохладно.

На пикнике в Институте полиомиелита во время международного симпозиума

Экард Виммер
«Ручеек». На переднем плане я с Элли Эренфелд

Литература

1. Агол И. Хочу жить. Агол В. Так и жили. М.: Аграф, 2011. http://www.agrafbooks.ru/

2. Агол В.И., Дроздов С.Г. Михаил Петрович Чумаков и живая противополиомиелитная вакцина. В кн. «Воспоминания о М. П. Чумакове» (изд. 2-е, дополненное). М.: Ин-т полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, 2009; с. 55–57.

3. Agol V.I. In Pursuit of Intriguing Puzzles. Virology 2020. 539: 49–60. DOI:  10.1016/j.virol.2019.10.006.

4. Koonin E.V., Krupovic M., Agol V.I. The Baltimore Classification of Viruses 50 Years Later: How Does It Stand in the Light of Virus Evolution? // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2021; 85: e00053-21. DOI:  10.1128/MMBR.00053-21



https://pcr.news/
Добавить в избранное