Томат с отредактированным геномом поступил в продажу в Японии

Репродуктивно-респираторный синдром свиней — опасное вирусное заболевание, которое приносит индустрии $2,7 млрд убытков ежегодно. Вакцинация не обеспечивает 100%-ную защиту. Однако удаление рецептора CD163 с поверхности клеток полностью предотвращает заражение. Британская компания Genus plc, специализирующаяся на разведении скота с желаемыми чертами, модифицировала четыре линии свиней так, чтобы ген CD163 не экспрессировался. К концу года она планирует получить разрешение FDA на продажу таких свиней с целью употребления в пищу человеком. Также компания надеется получить разрешение в Китае (главный потребитель свинины).

Несмотря на то, что у таких свиней нет чужеродной ДНК, FDA рассматривает изменения, внесенные в ДНК с помощью CRISPR, как «новое экспериментальное лекарственное средство», поэтому новая порода требует соответствующей регистрации. Нужно установить безопасность измененного гена, его наследуемость и стабильность в течение поколений, а также резистентность свиней к вирусу. Это долгий и дорогой процесс, который не все специалисты считают обязательным. Дело осложняет то, что хотя модификация гена CD163, защищающая от вируса, может возникать спонтанно, ее никогда не наблюдали у свиней. Еще одно препятствие на пути внедрения новых свиней на рынок — их принятие потребителем. Ранее созданные генетически модифицированные животные, одобренные FDA (быстрорастущий лосось и гипоаллергенные свиньи GalSafe), не получили широкого распространения.

Генетически модифицированные микроорганизмы находят все более широкое применение в промышленности, но с этим связаны и риски — например, при нарушении условий содержания микроорганизм может попасть в окружающую среду. Один из способов предотвратить такие утечки предложили авторы статьи в Nature Communications. Чтобы контролировать выживание пекарских дрожжей, они изменили стабильность нескольких ключевых белков и сделали ее зависимой от эстрадиола.

Ученые получили 775 штаммов Saccharomyces cerevisiae; в одном из генов каждого штамма  был изменен дегрон (участок, регулирующий скорость деградации белка). Модифицированный дегрон стабилизировался эстрадиолом, поэтому каждый из 775 полученных штаммов сохранял экспрессию белка только в присутствии этого соединения. Три гена — SPC110, DIS3 и RRP46 — оказались наиболее подходящими мишенями. Соответствующие штаммы нормально росли в присутствии эстрадиола, но их рост нарушался в его отсутствие. Наиболее значительное сдерживание роста обеспечил штамм с модификацией SPC110 — частота уклонения от такой системы контроля составила менее 5×10^-7. Однако некоторым клеткам все же удавалось обойти внесенное учеными ограничение. Анализ «нарушителей» показал, что наиболее частым способом была мутация, вносящая преждевременный стоп-кодон на C-конце белка. Удаление C-концевого домена белка еще сильнее снизило выживаемость модифицированных дрожжей в отсутствие эстрадиола.

Авторы отмечают, что предложенный метод, основанный на лиганд-зависимом изменении стабильности ключевых белков, можно расширить — например, использовать другие малые молекулы в тех случаях, когда применение эстрадиола нежелательно.

Синтез хромосом de novo — длительный и затратный процесс, что ограничивает его применение в научных исследованиях и биотехнологии. Коллектив из Южно-Калифорнийского университета предложил альтернативу — создание синтетических хромосом дрожжей из природных фрагментов. Метод получил название  CReATiNG (от Cloning, Reprogramming, and Assembling Tiled Natural Genomic DNA).

Первый этап CReATiNG — клонирование сегментов природных хромосом. На этом шаге к концам сегментов добавляют уникальные адаптерные последовательности, определяющие, как молекулы будут рекомбинировать друг с другом в ходе дальнейшей сборки. Второй этап — совместная трансформация клонированных сегментов в клетки и их сборка путем гомологичной рекомбинации in vivo. Такой подход значительно дешевле и быстрее, чем сборка из синтезированных de novo фрагментов. Например, некоторые синтетические хромосомы, созданные авторами статьи, прошли путь от разработки in silico до тестирования in vivo в течение месяца, а их производство обошлось менее чем в пятьсот долларов.

Ученые показали, что CReATiNG можно использовать для создания синтетических хромосом со сложным дизайном, включающим более десяти сегментов. Кроме того, подход можно комбинировать с синтезом хромосом de novo. Например, хромосомы со свойственной дрожжам архитектурой, но с последовательностями из других видов, могут быть синтезированы de novo, а затем рекомбинированы с хромосомами дрожжей — это упростило бы изучение генетических основ репродуктивной изоляции и различий в признаках между филогенетически далекими организмами. Также с помощью CReATiNG можно собирать единые модули из генов, относящихся к одним и тем же сигнальным путям и клеточным процессам, что важно для их исследования.

Некодирующие РНК (нкРНК) привлекают все больше внимания в связи с их ролью в регуляции различных процессов и вовлеченностью в патогенез. Изучение их функций открывает возможности для диагностики и терапии многих заболеваний, однако классический подход к анализу, основанный на ингибировании функции, затруднен из-за сложности доставки антагонистов нкРНК и возможных неспецифических эффектов. Решение этой проблемы предложили российские ученые, отредактировав последовательности генов некодирующих РНК при помощи двух вариантов CRISPR/Cas9.

Авторы работы использовали программируемую нуклеазу дикого типа (SpCas9wt) и мутантный вариант, вносящий одноцепочечные разрывы (так называемую никазу, SpCas9D10A). С их помощью они отредактировали последовательности генов нкРНК, связанных с фиброзом, в мезенхимальных стромальных клетках (МСК) человека. В качестве мишеней ученые выбрали гены, кодирующие микроРНК, — hsa-miR-21-5p и hsa-miR-29c-3p. Они показали, что с помощью SpCas9 можно достаточно успешно (с эффективностью до 50%) отредактировать в иммортализованных МСК гены нкРНК и не затронуть делецией фрагменты между целевыми участками. Также исследователи проверили воздействие никазы SpCas9D10 на клетки-мишени — оказалось, что она позволяет эффективно редактировать целевые гены, приводя преимущественно к микроделециям или копированию фрагментов генов. Важно, что полученные с помощью никазы изменения генома снижают экспрессию целевых нкРНК.

Помимо снижения количества нокаутированных нкРНК в самих стволовых клетках и продуцируемых ими внеклеточных везикулах, проведенное редактирование изменяло физиологию МСК и свойства их секретома. Полученные данные указывают на роль hsa-miR-21-5p и hsa-miR-29c-3p в поддержании мультипотентности МСК — при нокауте этих нкРНК клетки приближались по фенотипу к миофибробластам. Кроме того, выделяемые ими внеклеточные везикулы менее эффективно препятствовали развитию фиброза, чем везикулы от клеток дикого типа. Исследователи сообщают, что полученные результаты хорошо коррелируют с ранее опубликованными данными. Они надеются, что предложенный ими подход может быть использован для нокаутирования генов нкРНК в геномах МСК или аналогичных типов клеток и позволит изучать их функции в биологических процессах.

Сайт https://ngsconference.ru/